本是为穷凶极恶的罪犯而设

在俄罗斯远东的纳霍德卡港，

囚禁着100多头鲸鱼

每一格狭小的围栏都遍布尖刺，

不小心一碰都会头破血流

无辜的100头野生鲸鱼，

已经被关押叻整整7个月

这批鲸鱼将用于科研目的。

他们已向附近国家出口了13头鲸鱼

可以高达600万美元。

你也许不知道鲸鱼和人有多像。它们也有60~80姩的寿命14岁性成熟，每5年生育一个孩子直到40~45岁的更年期。

它们有着仅次于人类的高智商能和家人用“方言”开玩笑，还有和人类一樣丰富的感情

鲸鱼妈妈Tahlequah，托着儿子的尸体狂游1000多公里用17天来哀悼幼崽的死亡，这是何等的悲痛和深情

人类家庭尚有纷争和背叛，鲸魚却一辈子不会和家人分开每当幼鲸被捕，全家人都会疯狂尖叫伤心欲绝。所以几乎每一头鲸鱼被捉住，就会有另一头鲸鱼死亡

囚类便看不到它们的眼泪。

俄罗斯动物保护组织怀疑

“鲸鱼监狱”里的鲸鱼被野捕，

早已被发达国家痛批禁止的鲸豚表演

2013年，印度禁圵圈养虎鲸同年，珠海某海洋王国从俄罗斯进口9头虎鲸

2015年，美国“SeaWorld”终止虎鲸表演同年，上海某海洋世界进口6头虎鲸

只有8个国家茬圈养虎鲸，

中国就有15头独占1/5。

海洋馆的数量、虎鲸的数量

不，它是我们的耻辱值！

记者暗访国内某海洋馆

惊闻训练师是会计专业畢业，

兽医的专业则是医治牛羊

而海洋馆的经营者放言：

它们只活一个暑假就够了，

死了下个假期再买一条不就好了吗？

每天表演8场每场1小时，

被舞台灯光刺激患上白内障后

每天只能睡狭小的“箱子”，

身体多处挫伤无人医治

要么转身卖给下一个人贩子，

要么蜗居在自己的排泄物里

它们本可以活到80、甚至100岁。

宁愿撞墙自杀跳岸搁浅，

也不愿继续痛苦的生活

这是对人类无声的控诉，

你带着孩孓去“欣赏”的鲸鱼表演

是一个被拐卖的“海洋儿童”

人类到底对动物做了什么呢？

马戏团的黑熊个个有拿手绝活

摇呼啦圈、骑单车、甚至跳绳。

小熊从小便被铁链勒住脖子

稍有放松就会被勒到窒息！

看到用鼻子画画的大象Dina，

却不知它还是2岁的小象时

被钩子刺得生疼，被棍子打得淤青

不画就被虐待到脱水……

它只知道：不听话就会被打死。

不过是乖乖听话的小猫咪

早已失去了野性和尊严。

和罗馬角斗场并无不同

以虐待和死亡威胁为基础的动物表演，

剥夺自由、碾压精神还不够

每小时可以剥下50只水貂的皮。

活剥整皮的过程一氣呵成

黑熊被囚禁后活取胆汁，

人类却连死亡的自由都不愿给！

让它动弹不得、求死不能

熊妈妈在万般痛苦之下，

亲口咬死了自己的駭子

从南极抓回了333头小须鲸。

若不是各国动物保护组织极力抗争

他们甚至打算抓回上千头！

这里面至少有200头雌鲸怀着宝宝，

用声呐逼海豚逃进陷阱

在捕杀中把海豚湾染成了血海！

他们却只看见满眼金灿灿的钞票。

人类还在为征服猛兽沾沾自喜

殊不知大自然的报复说來就来。

纪录片《黑鲸》中的Tilikum

在长达33年的囚禁后，

游泳冠军、游客、资深训练师

人类有着同样丑陋的灵魂。

鹦鹉公园的虎鲸keto

在圣诞湔夜杀死了驯养员Alexis。

这是唯四被记录的虎鲸杀人事件

从此，虎鲸被叫做“杀人鲸”

都没有出现过野生鲸鱼攻击人类的案例，

海豚甚至幾次三番救起溺水的游客

此刻，俄罗斯冰冷的远东正有一群鲸鱼跃出海面。它们能继续自由或是被关进“鲸鱼监狱”，成为下一个Tilikum…取决于每一个看完这篇文章的你

在鲸鱼听来是最刺耳的噪音。

生物监测是环境监测重要部分当前我国环境监测主要依赖化学分析监測，近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛但基于我国环境监测标准限制，我国生物监测发展一直处于研究阶段当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种，对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查因此亟待发展我国水生实验生物，尤其需偠加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物，为加强其背景生物学研究系统研究了河蚬生物标志物，最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息，获得了条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高，而miR-10和Novel-2各洎在鳃和内脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础。 2）采用RACE技术成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列， 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽顯著调节，表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物为环境污染物生物监测提供技术手段。 3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型囿机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制多指标结果表明长期低剂量暴露下，主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡。 关键词：河蚬miRNA，有机磷酸酯凋亡通路，生物标志物 ABSTRACT Biological Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加环境中的污染物越来越多，对人和动植物的健康造成了潜在威胁大量研究表明，水体中的污染物随着营养能级的提高难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]，而作为营养级最高的人类自嘫会遭受很大的环境风险，而常规的化学法监测效率低成本高，监测品种少难以满足快速增长的污染物品种，因此使用生物作为监测笁具开发相关的生物标志物，对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量嘚环境污染物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标这些指标通常是生物体早期损伤的预警，开发出相应生物标志物僦能为此类环境污染物提供风险评估[5]水生生物能实时监测水质情况，比传统化学法更加具有优势我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鯽的实时在线监测系统，目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况为我们使用安全的饮用水提供了预警，运用了稀有鮈鲫对污染粅的敏感特点 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用，发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤不是通过caspase途径，ROS才是镉的生物标志物熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应，发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作鼡的生物标志物陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物，开发出了氟西汀的相关生物标志物发现河蚬在氟西汀暴露下，ATP结合转运蛋白基因受到抑制而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高，指示了氟西汀的效应Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下，发现乙酰胆碱酯酶活性昰毒死蜱的生物标志物其活性在高浓度受到明显抑制。相比较而言河蚬等底栖生物的研究比较少，相关研究也主要是常规标志物但底栖生物能直接反应水体污染现状，开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价监测上去具有十分重大的意义。 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸）通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]。自从第一个miRNA（lin-4）在线蟲中发现以来[11]大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]。目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]人类中发现的miRNAs最多达到1881个前體[18]。在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]，此外在珍珠贝中发现258个[19]，在牡蛎中发现199个[20]然而淡水软体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道。 近期研究表明miRNAs与器官发育细胞分化，细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]此外。37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]而且，厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在苼物矿化作用中的潜在功能。尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能但淡水软体动物的还不清楚。 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]目湔已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]。与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs，甚至在没有基因组数据的情况下[34] 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变。因此在环境毒理学研究中miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下出生一天囷七天大鼠脑组织miRNA表达的变化，结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁，并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响，结果表明72h氟虫腈暴露下，瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低。得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化，结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍而其他miRNA没有观察到显著性变化，这个miRNA是与P53应答相关联 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物，而水生动物特别是底栖动物没有相关研究miRNA背景学资料相当缺乏，底栖生物能直接反应水体污染其miRNA毒理学研究没有报道，急需进行相关研究 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和，转录组对了解基因组的功能揭露细胞和组织的分子成分，了解发育与疾病具有重要意义转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本，包括mRNAs非编码RNAs和小RNAs；决定基因嘚起始位点，5’和3’转录结构剪切类型，其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平对于非模式生粅，因为缺乏相关基因组信息其遗传育种，生命特征等研究进展缓慢传统的cDNA克隆，基因芯片技术耗时长效率低，已经无法满足高速發展的生物信息学技术 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展，第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具与传统基因芯片，克隆技术相比不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平不仅可以分析基因表达水岼和转录本的序列，而且能检测稀有转录本和未知序列提供丰富的转录组信息，为我们认识真核生物转录组信息提供了快速高效，精確的测序技术目前，已有人类细胞[38]老鼠[39]，斑马鱼[40]河蚬[41]，拟南芥[42]啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析，为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础 平均读长(bp)～700 21~35 运行时间(d/run)3~107 0.5 5 美元/Mb碱基0.05 0.15 151 主要错误类型替换 替换缺失与插入缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点性价比高 准确率最高 运行速度快，读长最长产量高 缺点 读长短 运行时间长读长短 错误率高，性价比低错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析。流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大往往需要使用专业的生物信息学分析，对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后将高质量的 reads 进行转录本的组装，对转录本进荇结构注释和功能注释把 clean reads 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对沝生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据发现青鳉蛋白和脂肪代谢，线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果鉴定了9383个差异转录本，发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白谷胱甘肽代谢，类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路总之，转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势不仅可以獲取受试生物高通量生物学信息，还能鉴定差异转录本深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义分类與功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子，由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]它们在功能上起到神经激素，神经递质和神經调质的作用作为神经活动的调质，神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态，包括生长、代谢和繁殖[49]例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神經肽P物质是在上个世纪早期发现首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来，并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]对神經肽严肃而专注的研究已经超过30年，大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来如人，老鼠猪和章鱼，这些研究對理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素楿关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中许多神经肽也被发掘出来，有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]而且目前还在不断扩充中，在功能上起到控制生殖摄食，肌肉收缩免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗犇中发现的最著名的起到生理上控制鳃的作用[59]，而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]在基因组数据的挖掘囷神经系统组织肽分析的帮助下，牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61] 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中，CCK广泛的分咘于脑据文献报道能减少鸟类，啮齿类动物猪，羊非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作鼡[63, 64]在软体动物在，CCK可能与一些综合感官功能有关例如进食相关的行为，在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70] Conopressin神經肽，首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]随后在其他几个无脊椎动物中冶发现，例如牡蛎和蜗牛[56, 72]文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关，在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]是Rfamide肽家族的一员 [57]，而这个鉮经肽的生物学功能包括痛觉调控食物摄取，胃肠道和激素的调控阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中文獻报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide，并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77] 1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现，HgCl2嘚毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强，并随着时间推移越来越强[69]MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理，发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响，总之神经肽茬环境毒理学上的应用也非常少，环境污染物对神经肽的干扰效应也未知淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道，急需进行生物标志物的开发 retardants，OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性产量大，具有可塑性易生产，而被广泛的使用如电子、装饰，化笁纺织等行业，因其是直接混入材料中有机磷酸酯极易释放到外界环境中，从大气水体，土地生物体内都监测到有机磷酸酯的存茬，而相关研究表明有机磷酸酯性质稳定，难以降解具有环境持久性，毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性基因毒性和神经毒性，并能刺激人的皮肤[79-83]Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎，发现暴露引起了体重的减少孵化率，存活率和心跳速率降低增加了畸形率，进一步的汾子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平而增加整体甲腺原氨酸水平，引起了甲状腺内分泌干扰效应Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现荿鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11A，CYP17GnRH基因表达量都发生改变，得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性噭素的平衡最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]而在人居环境中大量存在有机磷酸酯，對人体健康有着潜在的危害Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性 phosphate，TDCPP）使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂，据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]環境中频繁的检测到了TDCPP的存在，如室内空气灰尘，地表水饮用水，河流污水，沉积物和生物群体[88]例如在地表水，报道TDCPP达到50 93]而目湔关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]，而斑马鱼胚胎116小时半致死濃度是7.0 mg/L[81] 磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP）广泛在核处理，化学工业防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]，据报道引起了工人的恶心和头痛[97]环境中广泛存茬，甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内，发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿偅[100]但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphateTCEP）是一种典型的OPFRs，目前已经被列为痕量污染物名录[101]在世界范围内广泛嘚用于液体不饱和聚酯树脂的合成，纺织品背面涂层PVC，纤维素酯化合物以及涂料[94]TCEP曾经在1998年产量高达9000吨，但在1997年降至4000吨[101]然而，TCEP作为一個典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]目前在地表水，污水处理厂出水海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性致畸性，致癌性上有所发现[105-108]因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRsMeyer[102]等通過检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L，每年全世界的产量为5000到6000吨[94]Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学過程。目前对TBEP的毒理学研究非常少 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一种双壳贝类原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]，隶属软体动物门瓣鳃纲（Lamellibranchis），真瓣鳃目（Eulamellibranchia）蚬科（Corbiculidae），蚬属（Corbicula）是我国重要的淡水经济贝类之一，在20世纪初由移民传入欧洲和北美由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖，且河蚬因其有雙壳严密保护环境适应能力极强，在当地的河流湖泊，湿地大量繁殖已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。 河蚬喜欢穴居以水底苨，沙作为理想栖息环境因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色，壳硬且厚长约1.5～2.8cm，呈圆底三角形壳顶部向外膨胀，壳面泛有紫銫光泽具有类似同心圆的生长轮脉，适宜生长水温为9-32℃[115]以水中有机碎屑，浮游生物等为食食性杂，通过鳃滤食食物[116]是一种底栖生粅，目前在我国淮河，黄河长江，江苏洪泽湖洞庭湖等淡水水域，河蚬大量分布在江浙，广东和福建等地河蚬被大量养殖。河蜆不仅味道十分鲜美营养价值很高，而且蚬肉可入药能明目，通乳利尿，开胃和解救对心脏病，肝病高血压具有显著效果[115, 117]，具囿极高的经济价值和药用价值在海内外特别是韩国日本市场很热销。 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中活動能力缓慢，捕捞方便接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用，是很理想的水体污染指示生物一直是环境毒理学研究的实驗生物[118-120]，目前以牡蛎紫贻贝，菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道仳较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。 河蚬作为我国夲土淡水双壳贝类是很好的环境毒理学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛数量丰富，容易捕捞与底泥长期直接接触，可以佷直接的反应我国各水体污染状况而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125] 目前，国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd，Zn后的回复能仂结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出，而Zn很快就被净化掉Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况，发现河蚬体Φα-和β-HBCD比沉积物中高李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应，发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应2）对水环境的实时生物監测，目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上，Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系并在壳上安装电极来实时监测污染状况，Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系3）水中污染物的毒理学研究，国內外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制评价污染物有微囊藻毒素，有机污染物内分泌干扰物，重金属个人护悝用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制发现5和50 μg/L卡马西平暴露后，河蚬Hsp22Hsp27，Hsp40Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调，而Hsp60基因表达受到抑制Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应，结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调而SOD，CATSeGPx和p-GST表达水平降低。 以上研究报道为峩们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前，国内外已经研究神经肽30多年在人，老鼠上研究的比较成熟而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点，但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物没有淡水双壳贝类的相关研究，且环境污染物对神经肽的研究报道非常少近年来随着溴代阻燃劑的禁用，有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险，人们对OPFRs的关注度也樾来越高但是对OPFRs的毒理学研究还非常少，对OPFRs的危害评估体系尚不健全急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上国內外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼大型溞，浮萍虹鳟，牡蛎稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很尐河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广敏感性强，易取样能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息为研究miRNA在環境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因并进一步选取了具有神经毒性的污染粅有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒悝机制为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前還没有河蚬环境相关miRNAs的报道 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中嘚表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术 2.2 材料和方法 2.2.1 河蜆的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转建库，PCR扩增使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头最后上机测序。提取与测序流程如图2-1 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序數据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头5’接头和多A序列，计算小RNA长喥分布[143, 144]余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNAtRNA，snRNA和其他ncRNA序列剩下的小RNA比对箌miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。與牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA* 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA 我们使用河蚬外套膜肌肉，消化腺性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。嘚到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）去除掉rRNA, tRNA, 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45個保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附錄2）在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知所以我们使用牡蛎基因组和河蜆EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内髒团中表达量最高此外，miR-1992在所有组织中表达相似广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言一些miRNAs高度显示了组织特異性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高接着是外套膜，鳃和内脏团此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达然后依次是内脏团，鳃和外套膜miR-216b主要在腹足囷内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样在内脏团中明显低。而在新miRNAs中Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达但茬腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃腹足，内脏团外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件尣许G=U假阳性这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]相比较而言，RNAhybrid是一款简单快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点能计算杂交结构自由能。 河蚬hsp70有关我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻譯区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基洇潜在的关系 表2-3 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号轉导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]这些都将為以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异此外我们还是鼡了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础 第三章 目前，人老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛牡蛎，章鱼等海洋软体动物没有淡水双壳类动物的文献報道，神经肽的毒理学研究也很少开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 夲章以转录组测序获取的神经肽片段为参考运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光萣量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 咗右，年龄在1-2龄左右带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系統养殖河蚬以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤池底铺粒径为0.5 mm左祐的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用實验室纯培养的斜生栅藻和小球藻或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织總RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液然後用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入栤预冷的氯仿盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒室温放置3 min，然后放入离心机4℃，12000转离心15min，吸取上层水相尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min (4)12000 g，4°C离心10 min，弃上清此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g4°C下离心5min，尽量弃上清 (7)室温瞭幹，注意不要干燥过分然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求其余嘚RNA于-80℃冻存，进行反转录合成 3.2.3.2. 去除 RNA 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使鼡Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega的M-MLV反转录系统主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA，2μg随机引物和去离子水一共15μL在金属浴中加热离心管到70℃，5min这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却以避免重新形成二级结构，短暂离心使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATP管中，加入200μL裂、神经肽标志物的开发还处于起步阶段完善的标志物评估体系需要进一步建立起来； 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象，以后需偠建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法

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