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人教版高中化学选修3《物质结构与性质》中习题的研究
优质期刊推荐基于结构的HAb18G/CD147同性相互作用的突变研究及其在肝癌侵袭中的功能--《第四军医大学》2012年硕士论文
基于结构的HAb18G/CD147同性相互作用的突变研究及其在肝癌侵袭中的功能
【摘要】：肿瘤发生侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的最主要的原因。在肿瘤的演进过程中MMPs发挥着重要的作用。肿瘤微环境中的多数细胞都可以表达和分泌MMPs，如肿瘤细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，内皮细胞等。MMPs能够降解多种底物，包括ECM蛋白，生长因子，细胞粘附分子以及MMPs本身[1,2]。MMPs研究最多的功能是基质重塑，由于细胞周围基质被降解，解除了基质对肿瘤细胞的束缚，从而利于肿瘤侵袭。CD147最早被发现是在肿瘤细胞和成纤维细胞共培养时能够诱导间质胶原酶（MMP1）的分泌[3,4]。之后的研究证实CD147能够诱导除MMP1外多种间质金属蛋白酶的分泌，包括MMP2、MMP3、MM9和MMP11[5-7]，并且表达CD147的肿瘤细胞本身或其条件培养基与成纤维细胞共培养时都能够诱导MMPs的分泌。
HAb18G是本实验室用肝癌异性抗体HAb18筛选肝癌cDNA文库获得的一个新的肝癌抗原，它高表达于人肝癌组织和高转移的肝癌细胞表面[8]，并且通过与Genebank序列比对发现HAb18G氨基酸序列与CD147一致，两者是由相同基因编码的单次跨膜蛋白，因此HAb18G是CD147家族成员之一[9]。既往的研究证实HAb18G不仅能促使肝癌细胞本身并且能刺激癌周的成纤维细胞分泌MMPs，促进癌周基质降解，从而促进肝癌的侵袭和转移[10]。同性相互作用是很多细胞膜蛋白和跨膜蛋白的作用模式，如整合素家族、钙粘素家族和免疫球蛋白超家族等。研究发现HAb18G/CD147分子也存在同性相互作用，但其同性相互作用的功能意义仍然不清楚。本研究旨在寻找维持HAb18G/CD147二聚体的关键残基，阐明HAb18G/CD147同性相互作用在诱导MMPs表达和肿瘤侵袭中的功能意义。
第一部分：基于结构的定点突变能够减弱HAb18G/CD147的同性相互作用
为了筛选维持HAb18G/CD147二聚体的关键残基，我们依据HAb18G/CD147胞外段晶体结构数据分析了维持二聚界面的主要作用力，选择了14个可能的关键残基，通过定点突变构建了15个突变体，表达纯化了突变体蛋白，然后我们采用Native-PAGE Western blot的方法初筛了原核表达的突变体蛋白在溶液中的聚合状态，结果提示突变体rM1、rM2、rM3、rM7、rM8、rM9、rM12、rM13、rM14、rM15形成二聚的能力显著减弱或消除，而后我们根据突变残基所处的二聚界面选择了4个具有代表性的突变体即M4、M5、M7、M14并且采用BiFC的方法进一步评估了所选突变体在活细胞中的聚合状态，结果提示，M7、M14的同性相互作用显著减弱。
第二部分：HAb18G/CD147的同性相互作用在肝癌侵袭中的功能意义
既往的研究证实了野生型HAb18G/CD147能够诱导上调p-MAPK水平、诱导MMPs的表达、促进肿瘤侵袭[11,12]，因此我们用上述实验中选择的4个具有代表性的突变体以及野生型CD147作为阳性对照进行相关功能实验以分析HAb18G/CD147的同性相互作用是否参与了肝癌的侵袭过程。结果提示，rWT、rM4、rM5均能上调p-MAPK水平、诱导MMP-2表达，rM7、rM14较rWT上调p-MAPK水平、诱导MMP-2表达的能力显著减弱。为了进一步证实以上结果，我们检测了突变体稳定表达细胞株中p-MAPK、MMP-2水平，结果提示，M7、M14组p-MAPK、MMP-2水平、肿瘤侵袭能力显著低于WT、M4、M5组。
综上所述，本研究证实了非糖基化的HAb18G/CD147胞外段能够形成二聚体、激活MAPK信号通路、上调MMP-2表达。我们证明基于结构的定点突变能够显著减弱HAb18G/CD147的二聚能力并且筛选到了维持其二聚界面的关键残基。本研究也证明了HAb18G/CD147同性相互作用参与激活MAPK信号通路、上调MMP-2表达和促进肝癌侵袭。因此本研究揭示了一个肝癌进展的重要机制，即在肝癌组织中高表达的HAb18G/CD147通过同性相互作用激活MAPK信号通路、上调MMP-2表达和促进肝癌侵袭。考虑到HAb18G/CD147在肝癌进展中的重要作用，研发抑制HAb18G/CD147形成二聚体的竞争性抗体或小分子拮抗剂将是治疗肝癌的有效策略。
【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R735.7【目录】：
缩略语表3-6中文摘要6-9Abstract9-13前言13-14文献回顾14-20实验一 基于结构的定点突变能够减弱 HAb18G/CD147 的同性相互作用20-45 1 材料20-23 2 方法23-32 3 结果32-43 4 讨论43-45实验二 HAb18G/CD147 突变体蛋白的生物学功能研究45-64 1 材料45-47 2 方法47-52 3 结果52-62 4 讨论62-64小结64-65参考文献65-76个人简历和研究成果76-77致谢77
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