1、项目一：焊接机器人1.打开Robot studio软件，单击创建新建空工作站，同时保存一下，如下图所示;2.选才? ABB机器人模型IRB1600,单击添加，选择承重能力和到达距离，选择 确定，如下图所示：jLgjjjy J白,而52TO - - 电口a国隔一i函，I：旧谭口公融 gMiE闻，必4“ 口1gi由他1 5 J轴疆Uh一bJ皿病部hR 日J： 4 ,. 能十rw裆b一于k雷W3J名-回:匚工T 2 - -事 ：Hi工WV芝：霭 9*：I5 JJH441*田忆。K*S xaI MiMi-鹏陆邙臣产I Q虻0!说二归h“*=r-直日廿E zaMu Pn 堂ag El la A打斛，w，2、whngfc;u工* 鼻胃i；,用 mM3.导入设备-tools-Binzel air 22,并拖动安装在机器人法兰盘上:4.选择建模-固体-矩形体，设定长宽高，点击创建:项用归炉同。叼”HI 土收？上出阳I HIM.i.血一也wte ，上 Ltu : . I I II S-3!?期室a”鼬励 hd4fllM:帕卜I 比SEI新工15砧t-s视I SJSX。ih-ip FiLn Ajfi Ixkiri d. ITiEiIpIlei.: 5 I5EI -jhrrrAik riiJZAIlli SIA t 山中- FJU M 汕 几口 ZTildkiia E必隔皿 t Jf dl LHu$4口心13、 i tiud.iiir.r ECW烟rI* r g甲W 心淞刘 XjZivS 迎1Wnll& T由L2C曙胃鼻74下V T R5.选择基本-机器人系统-从布局创建系统-下一步-下一步-完成;1.画 也11Ttkhh*b m： i ,同声沙揖mt可中pi璃. A?力日键碰。也加,裁I*嗝d 科也1-MeLg9入 C 幅噌代 hLrttkM Mluv.d mbhiL* Eldhh.5 19mM 1力方保）词4以思 1*号* H U i 0 I.Ecrr ur 安 有算阴 t_L*=flS2甲 g 的 吐.日电km仁雅fi*典kfi妒Mwi腕?饵EJ 尔江 3抑?工幅jm小4Ii!m.牡3Mr如仁4、空J*qm 题k 0*411E-eUI!如M,I*1h4-B二皂s-sa二*G并自僦应i二B臼片占r in咒罂nt流mi6.控制器启动完成后，选择路径-创建一个空路径,种变事件日志 事件日志 事件日志 事件日志 事件日志下下T下下午平午年年7.三若兰 苣提室三 一三一二茶11，厂 i岫ig=EjUtilU 如 i wwrS PtnHn.广 jTlt-JJrrjM/生就A x寸，.而*告3 -n蛀-A -1力元500电 r.路径制作完成后，选择基本-同步到VC,在弹出的对话框中全部勾选，并点 击确定，同步完成后选择仿真-仿真设定-将路径添加到主队列，选择应用-确定;12I hMiGt uia 工5、“IBDMM/HfiaT陋* Zh*L!haE.I：* * rv 国 & ST而；：13IlfKAfllE i 二fl JjHIq工工时上棒* ,力第号* /hrrt_w口日rri,c:乐|上p a1 3*.口 ,鼻,-*i置粒司.P4N.选择仿真录像，点击播放，开始仿真录像。5. AM 闻的11R1 - MUM* 工工WI SffwiIJlHlIMUHIM-M a IW之留号口 白h： nui_i:也 *H： riaFi_,而mWl14项目二：搬运机器人.新建空工作站-导入机器人IRB4600-选择最大承重能力，选择建模-固体-圆柱 体，添加两个圆柱体，半径为200mm,高度分别为60mm和6、500mm把其中一个 作为工具添加到法兰盘上，同时导入两个设备 Euro pallet如下图所示：15.右击物体 或在左侧布局窗口中右击物体名称，在下拉菜单中选择设定颜色来 更改颜色：口-3wjF3)J 1F用皿泗为RHZiWR 下与: 丽旧官Qn*3i t今 javaa Fl aww7i守丁皿CLgi!H1V由 Off.盹j EE*口联却np曲司InLRiai口隹出时日” 1iniZMii fE，口刖雇用已1止i Ei-VOhJI I*felHIi ttUMiHmOl-3FL:!f皿|J狂二中J 3JEBP*LnI即州的电KMtrtB - 融闻帷械EEiM-UKIAIMV*百 KiW醇S F7、?小姐=”-li/j、 一小”h型 MtZ电.根据布局创建机器人系统，细节与项目一相同，系统完全启动后，选择控制器-配置编辑器，在下拉菜单中选择I/O,在弹出窗口中新建Unit,细节如下图所示;Ejrkit 力Ftfeu ” Mu ie Tm 修”L：iU .XAF：U ZXaLdM H4!& 3 &H-I*IMEtudJMIl 由UHLeh irafiLHOvriz bih!StLih iW!H,啕WL=U, 工ritfaZlCi-.WUJXuB, i rm 口kidMW w二段3 farifr由gnul ESI K心用TrtK邮17邸pt d Lkrfe汇trmiiE M flu者唯* 口8、1Mt hH*w Mk* mw，w*UM 1 uidriHhorbflifti入3M -KI Ohl HkiC Mia Cut IFHE# sn 3K KX Fullh|r11Ts，Latau. Eu: rsuitill：EaauUm小电愣席5h1历/i*Lik- i:cq:id: Z Oektz wHLm inrRg:l E： Shi-rlz -IML1&I IbUfl*1 F aaBLIZUlifLin工lctLFfTHfhia, ”*inH44 iLMtlef liMthi Elwin LMLtL3k*0.耳 n D总忸rdwilHtmmDi&E1t HVh pa Aii31H*EC-D9、flirilH TO Qh!4 * - PIm r Sm*k 卜：111% Lab*5.Mt 3*由酝与*瓦FK 用/a u 3t.:h1史Lam. iiuiFtL 二能配匕-MH.*iLbMLIdid法ID 5Ll* II! if 144- 丁ikxr.5it#修hzl4ai： CmlxucL:m, ixjif :*1 工=7匚 *7IlMHX-D UEUeLibi 4vM abWh-rirlM*IlMllihlK3I FuiL tauctLem, 1x41*4. jtj-.VU4B3I”Ile 二dux ：1!icfuzi LaUu. Ejll: Txui 1*7 TiLt Jiuup S10、ssucrFmjiKjfrn flanri IfMlbVtd gfM4.Unit新建完毕后，右击新建signal,新建do1和do2,细节如下图所示:. _一IN 口如皿I.q fmrilE Lin HwLcrv .-3中 7Lej b ifiM- -； Ni+m* Lau :=W OK-iz,r*ii Lim 讨= 补卡工一盟事国岂FT怔砧# C RjI 中右4 5.、EMX 4如14瞰Do-triGstpiC brnyuAEM 丁 El敢 + mew5 K依mt Lptifnurl VJlma:grad Vdia .琳4wn Faiin 4f Hhm.f!J-23 kafd. .Uit.311、 ItJl MM *F土3 r.Luti! ZX11uadi!:.HWbLVdnw i；&teh1wiifc?3QIK4 haL；d工 m go:aiuaf 二皿ciXHit:ZJfrtEVlV射1Alim: t4 Fl mm -+ ilM1 - Cmwitr Btim*TMr 3H1RWXI和二lr.r hl- Fa!c ：?.：工 2 Id 4. M 二Ee Id/TmKU西二1f_：AirW PMlXlH g in 4 M CrilME -N时 JfttiM.阳“GU T Kl ImcI iana -Han 3BifibF3nTKil林二xutu u p ek由g z工bi”人:，LiM12、I Ml. 14b ! Ki “ CMIiHMi JIVI，91144E m:Jr Srt-cli i Hk it On!1-! krj1YictTJHTJWri9rl PiLhftfii -Fh.3 4aLl I1MdifirSHUUl解.：Zfar.m- 1 iLih 3vt:k*tet rartl 3*aait?KTEBU廉二IxKHL XW -MpMltAW R-t3 UdJtniw.:hMhv-wnmii 5 ： ” S I r Iewiw twrtj11 RM,呼二jpmd 5531：01 T. E QcfiKiK EmH1Zadib-fTfJKdYHi 1宇将毗Z 二3
；H他13、 MOX3T所消!Bdnr-：配i daui 2 .:丁d twhIEBKiibrMTHKUQii 旧,味45JLEhvri * t：T*-irlrr icirJ)MJib,1W：1树口hrm IbIiLmXaadih*14fKil正 = ci- JPJI种ET-LUCI：KJadib-JQHKil ,iF9：*5 HJ *TPSM皿皿 P SjJCdKZ.rou 口jucruf&aaar.，l% Z 4Wf-j T iMXJ三皿口力：U对F* ftTaL-：HF-lElkZy：3fHErt：T mIF朝 37开妣ni:-XElmF Than 玷：匕 1c t ! ud E：卜 ts 1MMJ14、MimtlK H41 Hwij n EK* w *工三3=工 13d1 tAL41f!3M：UE fedv WhPEl :Ji LWHM Am 1MM GF&nAa-Ffai.idiM ud3r-,力& Fufhidi f，1 H tah-E 9kr4rSrAfiL理ft 3e_Swu j Lttarladiuai 二 xroiLLi龄.ihfe* i Ep w.MkiliExtktwI nrliMr nrtRrlrsr IM rt -wtirrlE-E Et Aif Mi。T皆.WB E T：6 4 ah CrtliK k hvJ A.” 11. F&1 力丁二 ta L：! 4 it Cs15、iljcra Nr* K1*-S.U： 2- .-AXZJ E&- ；：&G .：-I心I k心掰2加1，SLijLtfla iMTiZf IF-Ol:7Jh_3nmrILpuL ili|i.tB4.rj ir，；&- STisrat-11 TTl丁
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13 Z 3i： E 3* 工 Uu16、ueim 1k制ad SlullJ T xi Lxtuiu favlSH%b dam I is：:-et twt 曲“” Ptul C|L|ICC fcVElnd Irm iHiLhiIviwtes E1% 1J)Tlirrh r 11k.dn-1，畤206.重启完毕后，选择仿真-配置-事件管理器-添加事件，细节如下图所示:Eafcf 叫广，!，_，1 F。/检I驾 处国_ *力，21I 拒 7 tAi5 v 近埠仁士三uara 屿小wFeBa c启动Jr七用信毛应国据岳田银a:1：片七三桶咯、提型幅1taJ,C1in期口口1DIMI7fl211TEH1DICPEDIIdr1d夜TinIFV117、EJJ3F51工1FV1EajQUK11wiiunBOnF：viicJUiitDODFVJICHAIHEDOiwiiEiirnmUliF信评豳_
二而附仙宅捻作岸恺号是ms r r J01B迎丈匚咋H任劳 TOC o 1-5 h z
T BEB1 .WmE)路径fath-lu指建桢板 r Sat Def a -iH t-指令生数她酶Si cnldot匚 4SU石曰H科曰石点.3d bartrun 口工作站元泰国 &J 石*一艺M JT1 T JWHJ1一J _L且却据,.明比I _信舄素自：至部信息.J）Sytt-m2 5 作油，己雨求E口母”t.m圣CL祚沾j 己稿认目 .JJSytam18、S Ct 作站，电机 TE 已创建目标点瓶运动指会0 日创庭口标点和运劭指令BBm创鹿目标点和这动拍餐（T 口已创建口标点和运动指令支 I）已创建目标点和运动指令（T i.动作指会已由建* 4L，山 . 4.ln$3.AUa_y25NjmRDbmyuni - *B8 RjObiXSIudw 515 2 RRF-sr S _JT_KCeiffijTtZ二岳QtijO二口IotKJn吗口房，/刨曲鞅聆I X,I -W- II - I栏品 揖住!修旦* X域 M-T*；励-V*J 口，肝七.浊stwre： T*ra*t_fiC成能一 Tif-,t_7!喻 ftajet dal电fc &tnyunWB19、l X值巨采隹工印信舄 T期JIR4*利吉邨H i：J已也0日灯.电靶国片专 Dm宙0日将必Ig珈U. .三做践断点阳媾.I n优jFM.启利三珈百方 .匚作?言三包工 ，KM 电itU. nr市* mhiz J7l的皿无外轴杷A. 口“. I fef S 4* 内上.AJiEF a 无扑也曲伯, 口吟M元外轴荒：白PrthBRS ScEJr 1-11*13.1.,RE 己乔曲M第华西 己存描机罟.HE时由2fL的4/20 下半 L 2* iTl3/1W TT I P* 2t 13/172（下中 L 24 anar4/2（下工l酒 下阡 L Lt.anaw下工t泞 SURTf泣 下工E7 ai20、sz-t/a 下工 l a 却13/m卜耳l女 的灯寸印下隼I 3J25BB 19“d hi TCta.5ijN恭修部erat|t3.|.=MJiQffHiaa 7看旧，K=用1431 疗iv-rrOK MWMt &MIUI-aSI融1也 K胃制鼻矽。i irtw4 OtiJ Kw_ T|_K H *tf2 lirprt.A 励frwrT Twfm.ZC HXfcbK de： Mi kl 一ISmu Tirrwt.SK K 皿巾；tuK.2 匚匕 ajMH La0 项目三：叉车搬运.打开软件，新建空工作站，导入机器人模型IRB4600,选择最大承重能力然后选择基本-导入几何体-浏览几何体-选择21、本地几何体-打开，如下图所示:28BE R&bOTu5iO 03I uttM 事亨,1*上旧司K号又件 nsMni.利用平移和旋转指令，将不同几何体按下图位置摆放整齐:293创建一个300*300*70的万体分别作为tool,将其创建为工具, 所示：具体操作如下图 X F网 叁*
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分类参数参数中文名参数所属域值取值范围单位默认值涉及到的指令子小区负荷分担SCLDLOL 子小区负荷分担的空闲全速率TCH信道的下限cell0～99%20RLLLC,RLLLP 子小区负荷分担SCLDLUL 子小区接受负荷分担的空闲全速率TCH信道的上限cell0～100%20RLLLC,RLLLP 子小区负荷分担SCLDSC子小区话务分担优先级cell UL,OL UL RLLLC,RLLLP 子小区负荷分担SCLD 子小区负荷分担的状态cell ON,OFF OFF RLLLC,RLLLP 指派到其他小区AW指派到较差小区（Assignm cellON,OFFOFFRLLOC,RLLOP语音组呼叫服务FBVGCHALLOC cellBCCHBAND,ANYBAND BCCHBAND RLVGC,RLVGP 语音组呼叫服务VGCHALLOC 话音组信道分配优先选择cell NOPREF,BCCHPREF,BCC BCCHPREFRLVGC,RLVGP 语音组呼叫服务VGPRIO 话音组呼叫优先级cell 1～151RLVGC,RLVGP 信道组数据CHGR 信道组号cell 0～15RLCCC,RLDGI ,RLCFP信道组数据DCHNO 绝对射频信道编号cell128～251(GSM800)RLCFI,RLCFE ,RLCFP 信道组数据NUMREQBPC 在信道组中的基本物理信道序号cell8～128,步进为8,系统SYSDEF RLBDC,RLBDP 信道组数据SDCCH 需求的SDCCH/8的数目cell 0～32RLCCC,RLCFP 信道组数据STATE 小区或信道组的状态cell ACTIVE,HA LTED RLSTP,RLSTC信道组数据TN SDCCH/8需要定位的目标时隙号码cell 0～72RLCCC,RLCFP 信道组数据CBCH 小区广播信道cellYES,NO NO RLCCC,RLCFP 信道组数据BCCD 在立即分配中信道组频率是否被允许使用cellYES,NO NO RLCHC,RLCHP 信道管理信道组SAS 单时隙分配策略cell QUALITY,M AIO,MULTI QUALITY RLGAC,RLGAP 信道管理/TCH 信道上的立即指派CHAP 信道分配方案cell0～130RLHPC,RLHPP 信道管理/TCH 信道上的立即指派CMDR 小区业务在信道上的最大数据速率cell96,144144RLDRC,RLDRP 信道管理/TCH 信道上的立即指派NECI 是否支持半速率cell 0,10RLSSC,RLSSP 信道管理/TCH 信道上的立即指派BSCMC BSCMC多重信道开关cell ON,OFF OFF RLCDC,RLCDP 信道管理/TCH 信道上的立即指派MC多重信道开关cell ON,OFF OFF RLCDC,RLCDP 信道分配优化DFRMAABISTHR cell 0～100%0RXMOI,RXMOC,RXMSC 信道分配优化DHRAABISTHR cell0～100%0RXMOI,RXMOC,RXMSC 信道分配优化ATHABIS Abis 引发的半速率分配开关cell ON,OFF OFF RLDAC,RLDAP 信道分配优化DHA DHR 开关cellON,OFF OFF RLDHC,RLDHP 信道分配优化DMSUPP 动态FR/HR模式转换开关cell ON,OFF OFF RLDMI,RLDME 小区内切MAXIHO最大内切数cell0～153RLIHC,RLIHP下载文档原格式(xls原格式，共22页)付费下载}

本发明涉及肿瘤细胞生物学领域，特别是涉及一种长链非编码rnalncrna070974及其应用。背景技术：肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和饮食双重因素影响。继发性肝癌(转移性肝癌)可通过不同途径，如随血液、淋巴液转移或直接侵润肝脏而形成疾病。而现如今，肝癌在我国已是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位列癌症相关肿瘤死亡率第三位。hcc具有起病隐匿、恶性程度高、进展迅速、易转移、病死率高、总体预后不佳等特点，严重危害人类健康。因此，研究肝癌早期转移机制以及抑制方法对于提高肝癌的治愈具有重要的现实意义。现今，肝癌的发生机制研究主要集中在蛋白编码基因，涉及到遗传学、表观遗传学、相关信号通路的研究，而蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列不足1％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码rna。其中长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)是非编码rna中最重要的一类转录本，其广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncrna序列的比例也相应地增大，并且lncrna可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，更重要的是，lncrna的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病相关联，但是对于众多的lncrna是如何在不同的疾病细胞中表达，一直是科研界所研究的重要方向。而本发明正是为了研究肝癌相关的lncrna及其两者之间的相关性而提供了一种新的技术方案。技术实现要素：本发明的目的是提供一种长链非编码rnalncrna070974及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过降低长链非编码rna的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长，该lncrna070974是多种癌症细胞潜在的抑制剂，有望用于癌症治疗。为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供一种长链非编码rnalncrna070974，该长链非编码rna的核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明还提供所述的长链非编码rnalncrna070974在制备抑制肿瘤细胞生长的制剂中的应用。优选的是，抑制肿瘤细胞生长的制剂包括检测长链非编码rnalncrna070974表达水平的荧光定量pcr检测试剂。优选的是，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。优选的是，荧光定量pcr检测试剂含有用于快速扩增引物和巢式反应引物组，所述快速扩增引物如seqidno：2-seqidno：5所示；所述巢式反应引物组如seqidno：6-seqidno：11所示。本发明还提供一种检测癌细胞的试剂，所述试剂通过荧光定量pcr检测所述的lncrna070974的表达水平，荧光定量pcr检测lncrna070974的表达水平的试剂含有用于快速扩增引物和巢式反应引物组，所述快速扩增引物如seqidno：2-seqidno：5所示；所述巢式反应引物组如seqidno：6-seqidno：11所示。优选的是，试剂检测样本为肝癌细胞。本发明还提供如所述的检测癌细胞的试剂在制备抑制肿瘤细胞生长试剂中的应用。本发明公开了以下技术效果：本发明公开一种长链非编码rnaincrna070974，前期研究中发现细胞内rna结合蛋白hur可以与多条非编码长链rna结合，而其中长链非编码rnalncrna070974受到hur的显著调控，降低hur也明显影响细胞内的lncrna070974表达。至今，这条长链非编码rna尚未被报道，发明人第一次扩增得到这条长链非编码rna，并且本发明通过细胞增殖试验、平板克隆试验、流式细胞分析试验等发现抑制细胞中lncrna070974水平，可以使细胞周期阻滞在g0/g1期，显著抑制细胞的增殖。因此，通过降低该长链非编码rna的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长，这也为该lncrna070974成为多种癌症细胞潜在的抑制剂，用于癌症治疗提供了有利的科学依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为lncrna070974全长扩增电泳图；(a)5’和3’race的rna电泳图，(b)lncrna070974全长的电泳图；图2为lncrna070974在染色体上的基因定位及序列保守性分析；(a)lncrna070974在染色体上的定位，(b)lncrna070974序列与脊椎动物序列对比分析图；(c)lncrna070974基因在细胞中的分布情况；图3为干扰lncrna070974分析干扰效率；图4为干扰lncrna070974对细胞增殖和细胞周期的影响；(a)cck-8实验分析抑制lncrna070974表达显著降低细胞的生长，(b)平板克隆实验验证，降低lncrna070974可以减少克隆形成，(c)流式细胞仪分析，抑制lncrna070974可以阻止细胞周期g0/g1，抑制细胞的生长。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。对长链非编码rna的发明，在前期的研究中发现细胞内rna结合蛋白hur可以与多条非编码长链rna结合，而其中长链非编码rnalncrna070974受到hur的显著调控，降低hur也明显影响细胞内的lncrna070974表达。通过生物信息分析和荧光原位杂交实验，发现lncrna070974定位于15号染色体长臂的26.3位上，其序列与灵长类动物有高度的相似性，而与其他生物同源性相差较大；定位于细胞质和细胞核中，主要分布于细胞质内(见表14)。利用cdna末端的快速扩增(race)技术，获得5’-race和3’-race产物，通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段长度分别为684bp、585bp。通过基因序列编码预测工具(codingpotentialassessingtool，cpat)预测lncrna070974的编码功能，其编码能力为0.0473，说明其没有编码功能。综合上述结果，证明发明人发现了一条新的长链非编码rnalncrna070974。上述长链非编码rnalncrna070974虽然是新发现的长链非编码rna，但是发明人认为其编码功能是通过网络软件预测出来的结果，而由于现有技术的各种限制因素的存在，其非编码功能可能存在不确定的问题。因此，为了更好、更准确的验证该长链非编码rnalncrna070974抑制细胞(尤其是肿瘤细胞)生长的功能，通过细胞增殖实验(cellcountingkit-8、cck8)、平板克隆实验、流式细胞等结果分析，发现抑制细胞中的lncrna070974水平，可以使细胞周期阻滞在g0/g1期，显著抑制细胞的增殖，进而证实了该lncrna070974确实是具备抑制肿瘤细胞生长的功能。其具体的试验验证过程详见实施例1。实施例11、rna干扰实验在细胞12孔板中加入100μl的opti-mem培养基，2.5μl的sirna(浓度20μm，由吉玛生物合成，见表17)，2.5μl的rnaimax试剂(由thermofisher购买)，混合均匀后，加入到培养皿中静置15min，铺8-10万个hepg2细胞，补加dmem培养基(由gibico公司购买)至1ml，混匀后放入到37℃、5％的co2培养箱中，培养24h。2、rna的提取和lncrna070974全长的获得利用invitrogentrizol法(由thermofisher购买)，按照试剂盒说明书进行rna的提取；使用总rna量的1000ng，按照primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，日本)试剂盒说明书进行逆转录。将上步提取的rna进行基因组dna的去除，按照5’-race和3’-race试剂盒说明书(takara，日本)进行操作，具体使用的引物见表1，表1race技术的引物序列表注：其中v是除t之外的三个碱基；n为a、t、g中的任一碱基。其中，5’rlm-race具体操作步骤如下：(1)cip水解rna5’端不完整的磷酸基团，在去酶离心管中加入以下反应体系(见表2)：表2再混匀、点离，37℃孵育1h。(2)终止cip反应，再次抽提rna，在上述去酶离心管中加入以下组分(见表3)：表3首先，振荡仪上涡旋振荡混匀，4℃，14000g离心5min，将上清转移至新的1.5ml去酶ep管中；其次，向上清中加入150μl氯仿，振荡仪上涡旋振荡混匀，4℃，14000g离心5min，将上清转移至新的1.5ml去酶ep管中；然后，取上清，加入150μl异丙醇，涡旋振荡混匀，冰上放置10min，4℃，14,000g离心20min；最后，弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀一次，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，挥发干燥后加入15μl无酶超纯水溶解沉淀。(3)tap去除5'端帽子结构，在去酶离心管中加入以下组分(见表4)：表4再混匀，点离，37℃孵育1h；(4)5'raceadapter连接，在去酶离心管中加入以下组分(见表5)：表5混匀，点离，37℃孵育1h；(5)逆转录，在去酶离心管中加入以下组分(冰上操作)，见表6:表6混匀，点离，42℃孵育1h；产物放于-20℃保存；所用的随机10聚体引物购自北京维百奥生物科技有限公司。(6)outer5'rlm-racepcr，在200μlep管中加入以下组分(冰上操作)，见表7：表7混匀，点离，设置如下pcr反应程序，见表8：表8产物放于-20℃保存或用于下一步实验。(7)内侧5'rlm-racepcr，在200μlep管中加入以下组分(冰上操作)，见表9：表9混匀，点离，设置pcr反应程序同outer5'rlm-racepcr。产物放于-20℃保存或用于下一步实验。3'rlm-race具体步骤如下：(1)逆转录，在去酶离心管中加入以下组分，见表10：表10混匀，点离，42℃孵育1h；产物用于下一步实验。(2)outer3’rlm-racepcr，在200μlep管中加入以下组分(冰上操作)，见表11：表11混匀，点离,设置pcr反应程序同outer5'rlm-racepcr。(3)inner3'rlm-racepcr，在200μlep管中加入以下组分(冰上操作)，见表12：表12混匀，点离设置pcr反应程序同outer5’rlm-racepcr；产物用于下一步实验。(4)pcr产物电泳配制2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉加入到40ml的1×tae缓冲液中，微波炉融化后，待冷却至55℃左右，加入1μlgoldview核酸染色剂，混匀后倒入制胶板中)，凝固后进行电泳(电泳120v，30min)。(5)目的片段回收首先，选取将电泳结束后的凝胶，放入到凝胶成像仪中，然后选取目的大小条带相同的片段，使用刀片进行切割下来，放入到ep管中；其次，加入适量的bindingbuffer(1：3加入，即0.1g凝胶加入300μlbindingbuffer)(购于上海生工有限公司)，恒温仪上55℃，使凝胶块彻底融化；然后，将上述混合液加入到dnaminicolumn回收柱中，室温，1000g离心1min；弃滤液，将柱子放回收集管，加入700μlspwwashbuffer，室温，13000g离心1min，重复一次；最后，在柱子中央加入20ulelutionbuffer，室温放置2min，13000g离心2min，收集滤液；即目的产物。(6)目的片段与t-vectorpmd18连接，在200μlep管中加入以下组分，见表13：表13混匀，点离，16℃连接反应过夜。对产物进行基因测序(由上海桑尼生物公司完成)，获得lncrna070974的全长(见图1b，其核苷酸序列如seqidno：1所示)。3、lncrna070974的保守性及编码功能预测首先，通过在noncode数据库(http://www.noncode.org/)中输入lncrna070974的全长序列，分析发现lncrna070974的功能尚未被研究。其次，在ucsc数据库(http://genome.ucsc.edu/)上对lncrna070974进行基因组定位，可见，lncrna070974位于15号染色体长臂26.3区域(图2a)，通过lnclocator数据库(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)对lncrna070974的细胞定位进行生物信息学预测，发现lncrna070974在细胞质和细胞核均有分布，但细胞质中占比66.18％(表14)。用phylop对100种生物中的lncrna070974进行序列保守性分析，发现lncrna070974在灵长类动物中同源性较高，与其他物种的序列同源性较低(图2b)。此外，还结合荧光原位杂交试验(fish)验证了lncrna070974主要定位于细胞质中(图2c)。最后，使用cpat(codingpotentialassessingtool)对lncrna070974的蛋白编码潜能进行预测，与已知的蛋白hur和已知的lncrnahaglros相比，发现lncrna070974不具有编码能力(表15)。表14lnclocator数据库预测lncrna070974的细胞定位表15利用cpat预测lncrna070974的编码能力4、荧光原位杂交技术(1)试剂准备预杂交液和杂交液的准备：分别将封闭液与预杂交缓冲液，按照1：99混合均匀；将封闭液与杂交液按照1：99混合均匀，两者在37℃孵育至透明澄清后使用；配制通透液：0.5％tritonx-100的pbs；(2)细胞处理首先：取出24孔板，放入无菌的细胞爬片，每孔加入1×104个细胞悬液，放入培养箱培养；待细胞密度约60％-70％时，每孔加入500μl1×pbs，在摇床上清洗5min；然后，加入4％多聚甲醛，室温静置固定10min，pbs洗涤三次；最后使用，1ml预冷的通透液，4℃静置5min，pbs洗涤三次。(3)装载探针首先，每孔加入200μl预热至澄清的预杂交液，37℃封闭30min；然后，避光条件下，将lncrnaprobemix、u6、18s内参探针储存液(20μm)恢复至室温，各取2μl加入150μl提前预热至澄清的杂交液中混匀；再次，弃预杂交液，每孔加入150μl含有探针的杂交液，37℃避光条件下杂交过夜；弃杂交液，42℃避光条件下，每孔加入500μl杂交洗液ⅰ(含有0.1％tween-20的4×ssc)轻晃洗涤5min，共三次；分别在42℃避光条件下，每孔加入500μl杂交洗液ⅱ(2×ssc)、500μl杂交洗液ⅲ(1×ssc)，分别轻晃洗涤5min；最后，使用pbs洗涤3次，然后使用dapi进行细胞核染色，pbs洗涤3次。(4)封片及观察取出干净的载玻片，在玻片中央滴约10μl抗荧光淬灭剂；避光条件下，用镊子小心取出细胞爬片，倒扣在含有荧光淬灭剂的玻片上，在荧光显微镜40倍镜下观察荧光情况。结果显示：lncrna070974在细胞质和细胞核中均有分布，主要定位于细胞质中如图2c所示。5、荧光定量pcr使用rpremixextaqtmii试剂盒，采用如下表16所述引物；表16再按照说明书进行，加好体系，在biorad仪器，按照以下程序进行：95℃3min，(95℃5s，60℃30s，72℃40s，循环40次)，72℃5min，95℃15s，60℃1min，95℃15s。反应后基因的相对表达水平，按照2-△△ct(△ct值＝ct目的-ct内参，△△ct值＝△ct实验组－△ct对照组)进行计算，求得基因的相对表达水平，以actin基因作为对照基因，分析获得si-lncrna070974-2干扰效率最高，达到99％以上(见图3)，后期功能验证使用sirna-2进行，具体序列见表17。表17lncrna070974的干扰序列6、cck8检测细胞增殖(1)si-control或si-rna2处理hepg2细胞48h后，细胞密度约为70％-80％；(2)将2组细胞进行胰蛋白酶消化，分别取2000个细胞，加入到96孔板中，待细胞贴壁后；(3)弃去旧培养基，每孔加入100μl的10％cck-8试剂的检测液，将细胞放回培养箱中孵育2h；(5)用酶标仪在0h、24h、48h、72h进行检测其在450nm处的吸光度，用来反映活细胞数量；结果发现，在培养24h时，si-lncrna070974-2组细胞的生长受到明显的抑制作用，随着时间的延长这种抑制作用更为明显(图4a)。7、平板克隆实验(1)si-control或si-rna2处理hepg2细胞48h后，细胞密度约为70％-80％；(2)将2组细胞进行胰蛋白酶消化，分别取3000个细胞，加入到6孔板中，于37℃，5％co2条件下的培养箱中，培养7天后，换成正常培养基(10％fbs完全培养基)，继续培养7天后，克隆长成肉眼可见；(3)使用pbs清洗2次，加入4％的多聚甲醛进行室温固定30min，弃去固定液，然后使用500μl的结晶紫染色30min；(4)弃去染色液，使用双蒸水洗去没有结合染色液，进行室温干燥；(5)进行显微镜拍照，并计算单克隆个数。结果发现，si-lncrna070974组单克隆的数目明显减少，说明降低lncrna070974可以显著抑制细胞的生长(图4b)。8、细胞周期检测：(1)si-control或si-rna2处理hepg2细胞48h后，弃旧培养基，1mlpbs清洗两遍，加入500μl不含edta的胰酶消化液，室温消化5min，将细胞转移至1.5ml的ep管中，4℃，2000rpm离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；(2)加入1ml预冷的pbs，4℃，1500rpm，离心5min，弃上清，洗涤细胞沉淀，重复一次；(4)加入300μl预冷的pbs重悬细胞沉淀，缓慢加入700μl预冷的乙醇，晃动ep管，避免细胞成团难以成为单个细胞，4℃过夜固定细胞；(5)将固定好的细胞4℃，1500rpm，离心5min，弃上清；(6)加入1ml预冷的pbs，4℃，1500rpm，离心5min，弃上清，洗涤细胞沉淀，重复一次；(7)加入500μldna染色液，涡旋振荡5-10秒混匀，室温避光孵育30min；(8)选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测，分析细胞周期变化。结果显示，细胞周期阻滞在g0/g1期，说明降低lncrna070974的水平可以使细胞周期阻滞在g0/g1期，抑制细胞生长。因此，流式细胞仪分析，lncrna070974可抑制细胞的增殖(图4c)。以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>温州医科大学<120>一种长链非编码rnalncrna070974及其应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2008<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tagagcgagaccctgtctcaatcaatcaatcaaaaacgacagagatagatagatagatga60tagattgatagatgatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagcaacat120ggtctaaatgagtctaggagtggagtgtccttgaacttggggagaccaccctccactgca180tttgcattattgatactatggctggagagggccttttgcctaaaagcttggagtatgttg240gggcccccgagagcaggtgagggccagaggttcagatcagaggatggaaaaaggaggtgg300agaacaggaaagaaaaacattttaataagaacaagcaggggtgatggaaagtatacacca360aggccattctctagcatcttaaggttctgcccagccagctgggaggccactgggcactgg420ctgctggggggaaaggaagaatctgctcccctaccccagccttcactgttgctttcctcg480cacgaaccccagactctatccttcctggttggctgtttaagtcctttcctgacaccccag540gctttgtggcttatctgagcacagaacagcatccttagatggtacagcactgagcaccca600ccttagatcctaggattcagtcccaccatccaaagcccctcaccactacagaccagccac660actaagggtgaccagatatcttagactcccttttgaaacaacaggaaccaaagtgcccag720ggcagagaacatcctgttgccaaaatagtggttctcaaccagggatgacttttgtcttcc780aggggacatttggcaacgtctggagacattttgggttgtcacaactggaaggatgtactc840acatccagtgggtggaggccaggaatgctgctaagcaccctgcaatgcacagcagccccc900atgacaaagaactgtccagaccaaaatgtcaatagtgccgaggttgagaaattccggcca960aaagaaatggaatcaaaaaagaaaattgtttgcaacttcatagagataccctcaatgaat1020aaaaccacatatggtttgacttctgtccctgttcctatgctgaagggaaacttgtacaac1080tttccctttttaaagtaaagagataccaccccactcttttttttttttaaacacagcaac1140agaagggccccaagttaaaaccagctctccagcctaaggactccacctggtggtcctctc1200tggaattaaatgaagttgaggttttattttgtttaattttttcattattcagttattttg1260tttaacatttttagttattttgtttaaatttttagttattttaacttttaagttatttta1320tttcttagttattttaacttgttattttaatttttttagttattttaactttttaaagtt1380attttaattctttagttattttgtttaacttttttagtttttttagttaaacaaaagttg1440cagtgaccggggcaggtgtgatggctcaggcctgtaatcccagcactttgggaggccgag1500gcagggacagggggcaggggaaatcacttcttaggtcaggagctcaagaccagcctggca1560aacatgacaaaaccccgtctctactaaaaatataaaaatcagccaggcatggtggcgagc1620gcctgtaatcccagctacttgagaggctgaggcacgagaatcacttgaacctcatgttat1680tcctcatgaggcggaggttgcagtgagccgagattccgccactgtactccagcctgggca1740acagagcgagactccatctcagaaaacaaagaagttccaagtacaatacaaagaaattcc1800ctcccaatttgagagtaagttgccgatataccctatgaccgccccccccccgccaatact1860tcagtgggtatttcctatgaacaacgacattctccggcacagccatcagactcaggaaat1920taacatcggtatgttattaccatcaaccctctgactgaattctagttctgccagttgtcc1980caataaagttcttagcaaaaaaaaaaaa2008<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggcaccacaccttctacaat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcctggatagcaacgtacat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gttgctttcctcgcacgaac20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gtgtggctggtctgtagtgg20<210>6<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>repeat_region<222>(（34）)..(.（57）)<223>v=a或g或c；n=a或t或g<220><221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(37)..(37)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(41)..(41)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(43)..(43)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(45)..(45)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(47)..(47)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(49)..(49)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(51)..(51)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(53)..(53)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(55)..(55)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(57)..(57)<223>nisa,c,g,toru<400>6gcgagcacagaattaatacgactcactataggtvnvnvnvnvnvnvnvnvnvnvnvn57<210>7<211>45<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gcugauggcgaugaaugaacacugcguuugcuggcuuugaugaaa45<210>8<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtttgacttctgtccctgttcc22<210>9<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggtgtgatggctcaggcctgta22<210>10<211>20<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggtggagtccttaggctgga20<210>11<211>20<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tagtggtgaggggctttgga20}