【摘 要】食用菌液体培养技术因其生产周期短、产量大、质量高、经济效益突出等优势而被广泛研究和应用。对食用菌液体培养技术的发展、食用菌液体菌种技术的优势以及液体培养技术在食品、医药等行业中的应用前景作了综述。

【关键词】食用菌液体培养 发展状况 优势 应用前景

食用菌液体培养又称深层发酵或液体发酵。主要原理是在发酵罐或三角瓶中加入液体培养基，通入无菌空气以增加培养基中溶氧含量，提供食用菌菌丝体呼吸代谢所需要的氧气，同时加以搅拌或振荡，并控制适宜的外界条件等，使菌体在液体深处繁殖发育，获得大量的菌丝体或代谢产物。目前，国外的食用菌深层发酵研究主要是获取风味物质（食品）和特殊代谢产物（医药、饲料），国内研究则集中在液体菌种的生产及提取代谢产物等[1，2]。本文对食用菌液体培养技术的发展、液体培养技术生产食用菌菌种的优势及其在食品、生物医药等行业中的应用和发展前景等加以介绍。

1食用菌液体培养技术发展状况

1.1食用菌液体培养法的起源与发展

食用菌的液体发酵是在抗生素发酵技术的基础上发展起来的，1947年美国的汉姆非特（HumfeldH）首先提出了液体培养法生产蘑菇菌丝体。1948～1954年他们选出了适合液体培养的蘑菇菌株。1953年美国人布洛克博士（S.S.Block）用废柑汁深层培养出了野生蘑菇。1958年沙克斯（SzuecsJ）第1个在发酵罐内培养出羊肚菌菌丝球。日本的杉森恒武等于1977年用1%的有机酸和0.5%的酵母膏组成液体培养基，取得大量香菇菌丝体。从此，食用菌的培植开始从农业生产跨入了工业生产的领域。

1.2我国食用菌液体培养技术的发展

我国是在1958年开始研究蘑菇、侧耳深层发酵。到1963年，已经能进行羊肚菌的工业化商品生产。从此，食用菌产品的获得开始由简单的农业种植而转入工业发酵生产。20世纪60年代末期，我国已能大规模采用深层发酵法生产食用菌，主要研究单位有四川抗生素研究所、三明真菌研究所、中国医药科学院药物研究所、上海新型发酵厂等。研究主要集中在药用菌的生产，如灵芝、蜜环菌、银耳芽孢等菌类[3]。20世纪70年代开始研究香菇、冬虫夏草、猴头、黑木耳等食用菌的液体发酵。20世纪90年代，由于发现食用菌多糖有抗癌活性，使得一些具有生理活性物质的菌类（如云芝、灰树花等）引起了更多的关注，针对这些菌类的深层发酵培养技术的研究也得到长足发展。

目前对食用菌液体发酵的报道很多，而在利用液体菌种直接用来生产食用菌子实体方面，国内只有少量的报道[4]。如甘肃省科学院生物研究所的李玉珍等研究了侧耳液体菌种在不同培养料上的性状表现，重庆师专的朱健勇等进行了液体发酵菌种生产金针菇子实体的试验，得到了菌丝生活力强、接种面大、发菌速度快的一些结果。但是这些试验一般也都停留在实验室阶段，没能在生产上推广应用。究其主要原因，是因为液体深层发酵的设备投入大、风险高，一般个体生产户不愿投入；接种技术不过关，在接种过程中往往容易产生污染；菌种不易保存，发酵以后必须马上投入使用等，因而造成了液体菌种生产子实体技术一直未能推广应用。

2液体培养技术制备食用菌菌种的优势

制备液体菌种一般只要5～7d，周期短，速度快。而培养1瓶固体栽培菌种需要30d左右，仅发菌时间就比固体菌种减少了1/2以上。此外，用液体菌种作为母种或原种来扩大培养原种或栽培种时，也要比采用固体菌种快得多。一般液体种要比固体种提前成熟10～20d。因为液体菌种有流动性，各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌芽，发育点多，内外上下一起长，6～12h菌丝萌发，15～20d可长满栽培袋，大多数品种10多天就可出菇。

由于固体菌种是靠接种块上的菌丝体蔓延长成的，这样不仅培养菌种的速度慢，而且处在菌种瓶（袋）上部和下部的菌丝体菌龄差异较大，一般要差20～30d，往往当下部菌丝体刚长到瓶（袋）底时，处在接种处的上部菌丝体就接近老化。而液体菌种则生长发育均匀一致，菌龄整齐，液体发酵5～7d时的菌丝体正值旺盛生长期，接种后萌发快，菌丝活力强，发育健壮。用其拌料栽培，其菌丝生长速度较一致，现蕾及出菇时间一致，便于管理、采收与加工。

流质状态的液体菌种还便于接种工作的机械化、自动化，有利于工作效率的提高，更适合食用菌的工厂化、标准化生产。并且液体菌种萌发速度超过了杂菌滋长速度，杂菌几乎没有滋生的机会，因此克服了杂菌污染的技术难题，保证了产品质量。

采用三角瓶或发酵罐生产液体菌种，产量高，原料便宜，成本不到固体菌种的1/3。同时，由于其生产周期短，不使用菌种瓶，可省去装瓶、挑弃污染瓶、接种、挖瓶等繁杂工艺，节省了劳力、电耗和空间。

3食用菌液体培养技术的应用与前景

3.1食品工业上的应用

液体发酵食用菌菌丝体的营养成分，无论是蛋白质、氨基酸，还是维生素的含量，都类似于子实体。目前食用菌液态发酵正在大量研究开发中，由于用工业化液体发酵来生产食用菌蛋白质，要比饲养家禽或家畜来获取蛋白质的时间短、效率高、成本低。因此，食用菌的深层发酵在食品工业方面将有很大的发展前途，将有望成为21世纪人类所需的主要蛋白质的来源之一。

3.2生物医药产业上的应用

食用菌在深层培养过程中会产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、维生素、具抗生素作用的多种化合物以及植物激素等多种生理活性物质，这些物质分别具有对心血管、肝脏、神经系统、肾等人体器官的防病治病作用以及抗癌、消炎、抗衰老、抗菌、提高免疫力等功效[6，7]。目前，许多液体发酵的食用菌菌丝体可用于制药，对于那些在人工栽培条件下不易形成子实体或者其菌丝体与子实体含相类似有效成分的覃菌，可以利用发酵产物代替子实体。现在，我国市场上供应的食用真菌药物，如蜜环片、灵芝菌片、宁心宝胶囊等均已采用液体发酵菌丝体制造。超级秘书网

液体发酵形成的菌丝体以及含有多种代谢产物的发酵液，是上等的饲料，一般作为蛋白质原料加入到饲料中，具有易吸收、转化效率高、经济效益好等特点，将是动物饲料中蛋白质的重要来源。

随着科学技术的发展，尤其是微生物学、蕈菌学、发酵工艺学和工程学的相互渗透和交叉，特别是发酵产物分离技术的发展，食用菌液体发酵技术在食品和医药等行业上的应用将更广泛、前景更宽阔。食用菌液体培养技术在制备食用菌菌种上的突出优势使其将成为我国食用菌生产工厂化、规模化的必由之路，并将促使我国的食用菌发展得到质的飞跃。

液体菌种的培养方式主要有振荡培养和发酵罐培养两类。振荡培养又称为摇瓶培养，是利用机械振荡，使培养液振动而达到通气的目的，是将斜面试管菌种接种到培养液中，置摇床上振荡培养。经摇瓶培养的菌丝体一般呈球状、絮状等多种形态，培养液呈黏稠状或清液状，有或无清香味及其他异味。菌液中因有菌体发酵产生的次生代谢产物，可呈不同的颜色。发酵罐培养是利用发酵罐进行深层液体培养。

采用摇瓶培养液体菌种时，可以采用往复式摇床或者旋转式摇床。往复式摇床的往复频率一般在80～140r/min，冲程一般为5～14cm，在频率过快、冲程过大或瓶内液体过多时，振荡使液体容易溅到瓶口纱布上而造成污染。旋转式摇床的偏心距一般为3～6cm，旋转次数为60～300r/min，它的结构比较复杂，加工安装要求比往复式摇床高，造价也较贵，但是氧的传递好、功率消耗低，培养基一般不会溅到棉塞上。因此，要根据实际需要选择合适的摇床及振荡速度。

1．摇瓶培养的工艺流程 制备培养基一分装一灭菌一冷却一接种一摇床培养一一级液体菌种一二级液体菌种。

(1)培养基的配制 按配方称好各种成分，装入容器中，加水溶解后，分装入三角瓶中，一般250～300mL三角瓶装50mL培养液，500mL三角瓶装100mL培养液，塞上棉塞，用报纸包扎；也可用8层纱布做成8cm×8cm的瓶塞封口，外面用牛皮纸封口。

(2)灭菌一般采用高压灭菌方法，灭菌要求121℃、30min。取出冷却到30℃左右，放人无菌室或接种箱内备用。

(3)接种 按无菌操作要求每瓶接入2～3cm2的斜面菌种一块，每支斜面菌种可接4～5瓶。接入的菌种稍带点培养基为好，能使其浮在培养基的表面，接种后用原塞瓶口的纱布展开后盖在瓶口，并用线绳扎牢。

(4)培养接种好的菌种瓶可置于摇床上培养，也可置于24～26℃恒温下静置培养48h后，待气生菌丝延伸到培养液中后再进行振荡培养。往复式摇床的振荡频率为80～120r/min，旋转式摇床的频率为150～220r/min，摇床培养3～4d即可。培养结束时，因菌种不同，培养液出现不同色泽，如平菇、金针菇的培养液呈浅黄色；香菇、猴头菇的培养液呈红棕色，并有菇香味；木耳的培养液呈褐色，黏稠有香甜味。培养液经检测，无杂菌污染，菌丝干重达10g/L，菌丝球直径在1～2mm时，方可用于生产或进一步扩大培养。

(5)二级液体菌种制作 二级液体菌种培养基的制作同一级液体菌种，培养容器要大些，可采用5000mL三角瓶，装量不超过3500mL。灭菌冷却后，将已经发酵好的一级液体菌种按5%～10%的比例接入5000mL三角瓶中，置摇床上培养，转速要适当慢些。经过一定时间的振荡培养，就可得到菌球均匀分布、发酵液清澈透明的液体菌种。

3．影响摇瓶培养的因素

(1)培养温度食用菌菌丝的增殖及次级代谢产物的产生都在各种酶的催化下进行，而酶的催化反应需要适宜的温度，多数食用菌的最适温度在22～30℃范围内。如香菇为25～26℃，金针菇、平菇为22～25℃，灵芝为28～30℃，云芝为30～31℃，猴头菇为24～26℃。培养温度过低，菌丝生长缓慢；培养温度过高，菌丝球松散、稀疏、活力降低、质量变差。

(2)摇床的振荡频率和摇瓶的装液量摇床的振荡频率和摇瓶的装液量直接影响到培养液中氧气的含量。摇床的振荡频率越高，摇瓶的装液量越少，则培养液中溶解氧的含量往往越高。

(3)培养液酸碱度培养液的酸碱度直接影响营养物质吸收、酶活性及菌丝球生长等。培养液的酸碱度必须在灭菌前调整合适。大多数药用真菌的液体发酵，多采用自然pH或控制在pH5. 0～6.5的范围内。如果需要对培养液pH进行调节，可采用低浓度氢氧化钠及盐酸进行。为了防止培养液中酸碱度的剧烈变化，也常在培养液中加入碳酸钙、磷酸盐等缓冲物质。

培养液的酸碱度一般会随着菌体的生长而变化。发酵培养到了中期，多数菌丝会产生一些酸性物质如乙酸、柠檬酸、草酸等造成培养液pH下降；到了发酵后期，有的菌种菌液中pH会回升。一些无机盐，如碳酸铵被菌丝利用后，会引起pH值下降。葡萄糖作为碳源时，因丙酮酸迅速积累，会引起pH下降；而以乳糖为碳源时因乳糖的吸收较缓慢，pH下降较慢。因此，测定不同菌龄时培养液的pH，对了解菌丝的生长、代谢、生理生化反应等是一项重要的参数。要精确测定pH，可用酸度计进行，也可用pH试纸先进行粗测。摇瓶培养的pH测定必须将菌液倒出测定。

(4)接入菌种的菌龄接入菌种的菌龄可以影响到摇瓶培养的结果。如菌种老化，则生活力降低，摇瓶中菌体的生长速度减弱，形成的菌丝球减少，培养的液体菌种的质量则较差。所以，应当选择生活力旺盛，生长健壮的试管斜面菌种进行摇瓶培养；如果是二级液体菌种制作，则接入的液体菌种的菌龄也不应老化。

(5)接种量摇瓶培养的接种量指一级摇瓶种子对二级摇瓶所接入菌液量与培养液的比值。如对二级摇瓶1000mL的培养液中接入50mL的菌液，称接种量为5%。这种接种量的计量方法比较粗糙，并不精确。理论上应以接入菌丝的克数来计量。但在实际操作中因步骤繁杂、易污染而难以实现。一般来讲，摇瓶培养的接种量越大，培养周期越短，反之则长。食（药）用菌液体发酵的接种量一般在5%～30%，但接种量并非越大越好。例如银耳孢子的液体发酵，其最适接种量为5%～10%。生产上的最佳接种量是以目的物的产量及生产成本综合考虑的结果。此外，接入菌液的菌丝状态将显著影响菌丝的增殖及次生代谢产物的产生。一般可采用匀浆器将菌球打碎成菌丝片段或在摇瓶中加入玻璃球将菌球分散，菌种接入后方能显出迅速的增殖效果。

(6)培养液黏度 培养液黏度小，形成的菌丝球大，数量少，而黏度增加时，菌丝球直径下降，数量增多，产量增加。因而要根据液体菌种对菌丝球直径的要求，配制一定黏度的培养液，在生产中常加入琼脂和玉米粉增加黏度。

(7)光照 菌丝生长阶段对光线的需要量不高，应尽量避免直射光的照射。

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