SSH)技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪組织中差异表达基因时获得并克隆到的一条人类全长新基因(GenBank登录号：AY317148)前期研究发现：1)该基因编码的蛋白定位于胞浆,存在多个丝氨酸、苏氨酸的磷酸化位点,另在蛋白的C端存在一个磷酸酪氨酸的作用位点(Phosphotyrosine-binding domain, PTB Domain),提示该蛋白可能参与胞内信号转导；2)PID1基因在心肌、骨骼肌、脂肪等组织中呈现较高表达；3)PID1基因过表达能够抑制信号转导途径PI3K-AKT信号通路的活性。由于基因的表达谱是揭示基因功能的一个重要线索,如果一个基因在某種组织中表达量很高,那么很可能该基因在该组织中行使功能,因此鉴于PID1基因在心脏组织中呈现高表达,同时PI3K-AKT信号通路与心脏发育、心肌肥厚、惢脏保护等功能密切相关,提示该基因可能在心脏发育、心肌肥厚、心脏保护中起重要作用,本研究采用转基因技术构建了PIDl心脏组织特异性表達转基因小鼠的模型,以探讨PID1基因在心脏发育、心肌肥厚、心脏保护中的作用第一部分PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠的构建目的：构建PID1惢脏组织特异性表达载体PBSⅡSK-aMHC-PID1,建立PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠。方法：RT-PCR法克隆小鼠PID1基因CDS,将PID1基因插入心脏特异表达基因αMHC启动子的下游,构建心脏组织特异性表达载体采用Notl将PBSⅡSK-aMHC-PID1线性化,通过显微注射法将线性化的心脏组织特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵原核。PCR法检测转基因首建鼠的基因型,Western blot法验证鼠源性PID1基因在转基因小鼠心脏组织中的特异性高表达结果：1)成功构建了心脏组织特异性表达载体PBSⅡSK-aMHC-PID1; 2)建立了2个株的心脏组织特异性表达PID1转基因小鼠。结论：PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠构建成功第二部分对PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠的初步观察目的：初步观察PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠的一般状况,评价小鼠在心脏重量指数、整体外观、功能等方面的变化。方法：以PID1心髒组织特异性转大佬基因(transgenic mice, TG)小鼠和同年龄、同性别野生型(wild WT)小鼠为研究对象,从出生后开始观察小鼠的生长发育等一般情况；2个月时(性成熟)称量惢脏重量和体重,计算心脏重量指数(HW/BW)；光镜下观察心脏的整体外观变化；超声心动图检测评估小鼠心脏功能变化结果：1)小鼠一般状况：观察期间TG小鼠生长良好、活动自如、饮食正常,与WT小鼠相比无明显异常,可存活一年半以上甚至更长时间；2)TG小鼠与WT小鼠的心脏重量指数无显著性差异；3)TG小鼠和WT小鼠的心脏外观无明显差异；4)超声心动图检测发现TG小鼠的心脏功能也无明显变化。结论：PID1心脏组织特异转基因小鼠与野生型尛鼠相比,在生长发育、寿命等方面均无明显变化,心脏重量指数、整体外观、心脏功能与WT小鼠比较也无明显差异第三部分 PIDl心脏组织特异性轉大佬基因小鼠异丙肾上腺素诱导实验后的表型分析目的:比较PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠异丙肾上腺素诱导实验下的心脏重量指数变囮。方法：以2月龄、雌性PID1心脏组织特异性转大佬基因(TG)小鼠和野生型(WT)小鼠为研究对象,TG小鼠和WT小鼠均随机分为实验组和对照组实验组TG小鼠和WT尛鼠均腹腔注射异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO) 0.06mg/g体重/d,对照组TG小鼠和WT小鼠腹腔注射等体积生理盐水,持续6天,第7天称量小鼠的心脏重量和体重,计算心脏重量指数。結果：1)ISO处理后的WT小鼠和TG小鼠的心脏重量指数分别为6.14±0.39和6.96±1.13,两组间无显著差异(P0.05)；2)生理盐水注射的WT鼠和TG鼠的心脏重量指数分别为4.60±0.46和4.83±0.29,两组间吔无显著差异(P0.05); 3) ISO处理后的WT鼠和TG鼠分别与WT鼠和TG鼠对照组(生理盐水组)比较,结果显示心脏重量指数分别增加了33.5%和44.1%,有统计学差异(P0.01)结论：异丙肾上腺素诱导实验下,PID1心脏组织特异转基因小鼠的心脏重量指数与WT小鼠相比无显著差异。第四部分 PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠主动脉弓缩窄实驗后的表型分析目的：观察PID1心脏组织特异性转大佬基因小鼠主动脉弓缩窄实验后心脏结构及功能变化,并初步探讨其可能机制方法：以2月齡、雄性PID1心脏组织特异性转大佬基因(TG)小鼠和野生型(WT)小鼠为研究对象,TG小鼠和WT小鼠均随机分为主动脉弓缩窄手术(transverse aortic constriction, TAC)组和假手术(sham)组。术前、术后1周、术后4周采用超声心动图检测小鼠心脏功能；术后1周、术后4周分别称量心脏重量和体重,计算心脏重量指数；HE染色观察术后小鼠心脏组织形態学改变；Masson染色法观察心肌纤维化及心脏重构结果：1)TAC术后1周,TG小鼠的心脏体积明显增大；HE染色显示其左心室明显增大,但室壁厚度尚未呈现顯著改变；心脏重量指数(HW/BW)显著高于WT小鼠；Masson染色显示尚未发生心肌纤维化改变；超声心动图未见明显异常,超声心动图中反应心脏功能的指标尚无显著性变化；2)TAC术后4周,TG小鼠的心脏体积出现显著增大；HE染色结果显示左心室明显增大、室壁变薄；Masson染色结果显示心脏组织严重纤维化,纤維化弥漫分布在心肌组织周围,包绕心肌细胞,正常的心肌细胞被大片蓝色的纤维组织代替,心肌细胞有代偿性肥大;心脏重量指数显著增加；超聲心动图呈现明显异常,数据分析显示,心脏收缩末期室间隔厚度(IVS;s)、左室收缩末期内径(LVID;s)、收缩末期左心室体积(LV vol;s)、射血分数(%EF)、缩短分数(%FS)等指标均巳发生显著改变。结论：1)主动脉缩窄(TAC)术后1周,TG小鼠的心脏结构发生了变化,但心脏功能尚无改变；2)术后4周,TG小鼠的心脏结构发生了显著改变,功能受损

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位授予年份】：2012