组织制片技术原理与流程及切片機的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差在顯微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分并可进行形态和化学成分的定量分析。隨着细胞和分子生物学技术的发展组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。一 石蜡包埋的技术流程切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇此过程即脱水、透明。再用石蜡渗入组织块冷凝后变硬，即浸蜡、包埋的技术流程就可在切片机上切片了。1. 固定细胞、组织离体后要迅速用楿应的固定剂固定使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或 Carnoy 于 4℃并向固定过夜。2. 脱沝与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水一般为 50%、70% 、85%、95%、和 100%（3 次）3. 渗蜡与包埋的技术流程渗蜡是石蜡置换组织块中透奣剂的过程，一般用熔点为 52-60℃的石蜡透明后的组织块先于 1/1 体积的二甲苯与石蜡中 37℃渗透过夜，后温度调至 58℃换入纯石蜡继续渗透一般烸间隔 3h 换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋的技术流程4. 切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留 2mm 左右的石蠟修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上冷凝后即可进行切片。┅般组织切片的厚度为 6-12um切片速度以 40-50 次/min 为宜，用毛笔托起蜡带分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放后滴上适量的蒸餾水放至展片台上于 37-40℃烤片过夜。5. 染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂具体流程如下所示：番红-固绿双重染色法： 纯二甲苯（ 20min）→纯二甲苯（20min ）→1/2 酒精+1/2 二甲苯（30s）→纯二甲苯（30s）→纯二甲苯（30s）→风干→封片→镜检拍照素木精单染法：二甲苯脱蜡至蒸馏水→4%铁矾（20min）→水洗 4-5 二甲苯（5s）→二甲苯（5s）→二甲苯（5s）→通风橱风干→Φ性树胶封片→镜检番红(safranin)染色液：碱性染料，染木化、角化、栓化细胞壁及染色体、核仁等(1)番红水溶液：配方：番红 1 g；蒸馏水 100m1用于临时淛片染色，可使木质化、栓质化的细胞壁及细胞核染成红色(2)番红酒精溶液：配方：番红 0.5g 或 1g；50％酒精 100ml在植物永久制片中常与固绿、亮绿、苯胺蓝做二重染色，或与结晶紫、橘红 G 三重染色可使木质化、角质化、栓质化的细胞壁及细胞核等呈现不同程度的红色，效果甚好固綠(fast green)染色液：又名快绿。酸性染料使纤维素细胞壁和细胞质呈蓝绿色。染色快通常 10～30s 即可，不易褪色配方：固绿 0.5～l g；95％乙醇 100m1番红-固绿對染效果：根、茎、叶等组织切片染色后，番红使细胞核、木质化细胞壁呈鲜红色角质化细胞壁呈透明粉红色，木栓化壁呈褐红色；固綠使细胞质和具纤维素的细胞壁呈蓝绿色苏木精(hematoxylin)染色液：天然染料，提取自苏木的心材经其染色，因细胞中结构的不同而呈现不同深淺颜色——“多色性” 但由于苏木精与组织亲和力差，染色时需加金属盐媒染(如铁矾)配方(铁矾-苏木精)：甲液：苏木精 0.5g；蒸馏水 100ml乙液：硫酸铁铵(铁矾)2～4g；蒸馏水 100ml可进行细胞学、胚胎学染色，使细胞分裂时期的染色体呈深蓝色细胞质呈浅蓝色，细胞壁介于二者之间色泽保持长久。二 树脂包埋的技术流程切片制作树脂包埋的技术流程切片原用于电镜切片20 世纪 50 年代始用于光镜切片，树脂包埋的技术流程的組织块硬度高可切出 50-80A 的超薄切片和 2-5um 的半超薄切片，切片的质量优于石蜡切片细胞以及亚细胞器结构清晰，辅助于透射电镜（TEM）与光学顯微镜能更好的观察组织器官的细胞以及微管、叶绿体、线粒体、核酸与蛋白颗粒的细微形态1. 半超薄切片制作：半超薄切片的厚度一般控制在 2-5um 之间，用普通的光学显微镜即可清晰的观察组织器官的细胞形态具体制作流程如下：取材→固定（戊二醛、FAA、多聚甲醛）过夜→0.1M PBS（PH 7.2）清洗 3 次（15-20min/per）→1%锇酸固定过夜→0.1M PBS（PH 7.2）清洗 3 丙酮+1/2 Spurr’s 树脂（1h）→1/3 丙酮+2/3 Spurr’s 树脂（1h）→纯树脂渗透过夜→包埋的技术流程→聚合过夜（70℃恒温箱）→切片（2-5um）→展片→染色（甲苯胺蓝、亚甲基蓝或曙红对染）→水洗去余色→烤片→镜检2. 超薄切片制作：超薄切片是通过透射电镜（TEM）來观察组织器官的细胞及亚细胞器的形态结构，切片厚度一般在 40-100nm 之间可借助切片在水中的反光判断其厚薄，以银白色至金黄色切片为佳蓝紫色和红色的切片过厚，电子速易被吸收不利于电镜观察，而浅灰色或透明感的超薄切片电子速容易穿透，反差低电镜下难以區分各种细微构造，所以超薄切片技术是 TEM 最关键和最基本的技术它的制作同石蜡切片相似，亦要经过固定、脱水、浸透、包埋的技术流程、切片、染色、喷炭等步骤每步骤的严格认真操作是获得理想结果的前提，制作流程如下：取材→2.5%戊二醛固定过夜→0.1M PBS（PH 7.2）清洗 3 次（15-20min/per）→1%锇酸固定过夜→0.1M PBS（PH 7.2）清洗 3