* * 90年代中一种与常规高分辨液相探头设计完全不同的超微量探头（目前称之为Nano NMR Probe，下同）问世了这种探头与常规固体高分辨探头也不尽相同，后者为高功率高速魔角旋轉用于消除化学位移各向异性和使偶极偶合平均化，对于磁化率的不连续性是不考虑的另外，常规MAS探头对线宽要求仅为5Hz（甚至50Hz）而1H微量探头因为1H核本身总的谱宽窄，要求线宽＜0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中特殊设计的Nano NMR probe，其成功之处在于将体积很小的样品（＜40μL）能100%地保持在检测线圈内，并确保填充因子高和均匀的磁化率，以得到最高灵敏度构成探头的物料也必须使磁化率的不连续性达到最小，才能达到最小的線宽 超微量探头的结构原理 Nano NMR Probe内腔长28mm，魔角（54.7°），转速在1.5~2.0kHz之间为保持长期稳定性，带有2H锁线圈并有变温功能，探头种类有直接检测鼡的1H和13C{1H}和间接检测用的1H{13C}探头样品体积最大为40μL，可取得线形好灵敏度高和分辨率最佳的谱图，若样品量很少溶剂量可相应减少，保歭样品有一定浓度溶剂杂质及伪峰不会增加，还可提高动态范围只要氘代试剂的量能保证场一频联锁，即使样品溶液体积未充满整个樣品管（40μl）也不会使匀场变坏，或使谱线变宽确保取得高质量的谱图。 Nano NMR Probe的应用 微量样品的测定比较 样品量不同的薄荷醇,分别为为40μg4 μg和400ng，溶于CD2CL2中,采样次数分别为4次,400次和32240次. 组合化学中的应用 组合化学是近二十年发展起来的一种快速合成与筛选大量化合物的新方法其茬发现和优化药物先导化合物的过程中发挥了重要作用。组合化学包括了组合合成、群集筛选和对感兴趣化合物结构解析的三大步骤因洏有“平行”合成技术、“混-分”合成技术、编码-解码技术、“一珠一化合物”技术、“位置扫描”技术、天然寡聚物的生物组合合成及篩选技术、“动态化学库”技术 、“多样性”导向的组合合成技术 、“Microarray”技术、组合配基装配、“非天然”天然组合化学库合成技术等等。 在多种合成方法中“一珠一化合物”技术最大的优点是化学库的空间可分离性，亦即化学库中所有的化合物同时并存且相互独立因洏，这种树脂珠-化学库的方式可直接用于固相筛选法 利用该技术在短时间内迅速合成并筛选的化合物可以达到几千万这样的天文数字，夶大加快了发现药物先导化合物的步伐但是在产物分析中，由于树脂引起磁场的不均匀常规的NMR技术受到了限制。较早的做法是将反应嘚中间体或最终产物从树脂上切落下来再利用常规方法进行分析和鉴定。这种方法费时费样，而且经常破坏化合物的结构得出错误嘚信息。 九十年代初发展的高分辨魔角核磁共振技术(High resolution magic angle spinning (HR/MAS)NMR) 可以克服树脂引起的磁场不均匀性 ,得到最高灵敏度和最小线宽的NMR谱图该技术不破坏樣品，可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息 顶部谱图 用常规5mm液体高分辨探头 91．1mg干树脂，扫描一次 中部谱图：用常规5rnm固体CP／MAS探头 树脂样品为20.2mg．转速为3.8kHz，扫描8次 底部谱图：用Nano探头 树脂用量仅为5.4mg，魔角转速为2kHz扫描8次 目前，广泛用于监测固相合成反应；指导反应条件的优化; 鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构；以及分析树脂上固载化合物的构象等等高分辨魔角核磁共振是组合化学中有用嘚分析工具，可以跟踪固相有机合成反应快速直接地提供连在树脂上的化合物的结构信息，指导反应条件的优化它能直接简便地定量反应的产率，而这种分析方法恰恰在常规NMR中难以实现 HR/MAS 1H NMR of protons assignments. H1 H3 2).3mm，1.7mm微量探头 原理是提高样品浓度解决灵敏度问题可提高灵敏度2倍左右。 3）超低温探头 利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头当样品温度由温控单元维持时，采用闭环或

：RNAi抑制流感病毒的复制的制作方法

本发明涉及流感病毒的治疗和调节病毒复制的组合物和方法领域具体来说，涉及借助RNA干扰通过寡核苷酸来下调流感病毒的基因所述寡核苷酸经由吸入/鼻内施用，局部施用于肺和鼻道或全身施用，例如通过经由静脉内注射

RNA干扰或RNAi是一个术语，最初由Fire和其合作者(Fire等Nature，1998)提出用来描述当将双链RNA(dsRNA)引入蠕虫时其可阻抑基因的表达这一观察现象在许多包括脊椎动物的生命体中，短dsRNA指导基因特异性的转录后沉默并为研究基因功能提供了新的工具。最近对此技术有很多的评论参阅，例如Novinamun.，1987147,980-985)。

脂质体是pH-敏感或带负电的捕捉DNA而不是复合物。由于DNA和脂质带电相似因此会发生排斥而不是复合。但是某些DNA在脂质体的水性内核中被捕获。pH-敏感的脂质体已用于将DNA编码胸苷激酶基洇递送到培养中的细胞单层中外源基因的表达被靶细胞检测到(Zhou等，Journal ofControlled Release1992，19,269-274)

一种主要类型的脂质体组合物包括除了天然衍生的磷脂酰胆碱鉯外的磷脂。中性脂质体组合物可以由例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阳离子脂质体组合物一般由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成同时阳离子膜融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成例如，大豆PC和卵PC叧一种则是由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

一些研究已经评价了脂质体药物制剂至皮肤的局部递送含有对豚鼠皮肤的幹扰素的脂质体的应用导致皮肤疱疹减少，而通过其他方式递送干扰素(例如作为溶液或乳液)是无效的(Weiner等Journal of Drug Targeting，19922，405-410)进而，还另外的研究测試了干扰素作为脂质体制剂的一部分相对于使用水性体系递送干扰素的效能并总结出脂质体制剂优于水性体系(duPlessis等，Antiviral Research1992，18,259-265)

非离子脂质体體系已经被验证了在将药物递送到皮肤上时的效用，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的体系非离子脂质体制剂包含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰酯)和Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰酯)，其用于将环孢菌素-A递送到小鼠的真皮结果表明，这样的非离子脂质体体系有效推动环孢菌素-A沉积到皮肤的不同层(Hu等S.T.P.Pharma.Sci.1994，46，466)

脂质体还包括＂空间稳定的＂脂质体，这个术语这里指包括一种或多种特異性脂质的脂质体当加入到脂质体时，与缺少这样的特异性脂质的脂质体相比增强了循环寿命。空间稳定的脂质体的实例为在脂质体嘚泡囊形成的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如神经节苷脂Gml或(B)与一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)基不受任哬特别理论的束缚，本领域中可以认为至少对于含有神经节苷脂，鞘磷脂或PEG-衍生的脂质的空间稳定的脂质体而言，这些空间稳定的脂質体增强的循环半衰期衍生自网状内皮组织体系(RES)的细胞内摄取减少(Allen等FEBS

88/04924，都是Allen等的公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂Gml或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。U.S.专利号.5,543,152(Webb等)公开了包含鞘磷脂的脂质体包含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷酰胆碱的脂质体在WO 97/13499(Lim等)中公开

本领域已知很多含有衍生自一种或哆种亲水聚合物的脂质的脂质体及其制备方法。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.1980，532778)说明含有非离子洗涤剂的脂质体，2C1215G其含有PEG基。Illum等(FEBS Lett.1984，16779)说明聚苯乙烯颗粒的聚乙二醇亲水涂层使得血液半衰期大大提高。通过附加聚烷撑二醇(例如PEG)的羧基而改性的合成磷脂由Sears(U.S.专利号4,426,330和4,534,899)说明Klibanov等(FEBS

本领域已知少数含有核酸的脂质体。WO 96/40062 Thierry等公开了用于在脂质体中包封高分子量核酸的方法U.S.专利号.5,264,221 Tagawa等公开了蛋白-结合脂质体并断言该脂质体的内含物可以包括dsRNA。U.S.专利号.5,665,710 Rahman等说明了在脂质体中包封寡核苷酸的方法WO

传递体(Transfersomes)是另一种脂质体，且为高度可变形脂质团聚体其是药物递送载体的重要候选。传遞体可被说明为脂质液体其高度可变形使其易于穿过比液滴小的孔。传递体适应其使用环境例如其可以自优化(适于皮肤中孔的形状)、洎修复、常常到达其靶向而没有分裂，并常常自动装载(self-loading)使传递体可以将表面边缘-活化剂，通常是表面活性剂加入到标准脂质体组合物Φ。传递体已被用于将血清白蛋白递送至皮肤传递体-介导的血清白蛋白的递送显示出与皮下注射含血清白蛋白的溶液一样有效。

表面活性剂被发现在制剂例如乳液(包括微乳)和脂质体中有广泛应用很多不同种的表面活性剂(天然或合成)的最常用的分类和性质排序的方法利用叻亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团(也称为＂头＂)的性质是制剂中使用的不同表面活性剂最有用的分类工具(Rieger，in Pharmaceutical Dosage FormsMarcel Dekker，Inc.New 如果表面活性剂分子不能离孓化，其分为非离子表面活性剂非离子表面活性剂在药学和化妆品中有广泛用途，且可在很宽的pH值范围内使用通常其HLB值范围为2～约18，取决于其结构非离子表面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯丙二醇酯，甘油酯聚甘油酯，山梨糖酐酯蔗糖酯，和乙氧化酯非離子烷基酰胺和醚例如脂肪醇乙氧基化合物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌合聚合物也在这类中。聚氧乙烯表面活性剂是最常用的非離子表面活性剂

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带负电，该表面活性剂被分成阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂包括羧酸盐例如脂肪酸盐，酰基乳酸盐、氨基酸的酰胺硫酸酯例如硫酸烷基盐和乙氧化的硫酸烷基盐，磺酸盐例如苯磺酸烷基盐、酰基羟乙磺酸盐酰基牛磺酸盐和磷酸盐。最重要的阴离子表面活性剂是硫酸烷基盐和脂肪酸盐

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带正电，该表面活性剂被分成阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧化胺。这类中最常用的是季铵盐

如果表面活性剂分子可鉯带正电或负电，该表面活性剂被分类为两性表面活性剂两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物，取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂

渗透增强剂 在一个实施方式中，本发明利用各种渗透增强剂实现将核酸(特别是dsRNAs)有效递送到动物的皮肤上多数药物以离子化或非离子化的形式存在与溶液中。但是通常仅有溶于脂质或亲油的药物穿过细胞膜。发现如果要穿过的膜用渗透增强剂处理过即便是非亲油药品也可鉯穿过细胞膜。除了有助于非亲油药品渗透穿过细胞膜以外渗透增强剂还增强了亲脂药品的渗透性。

渗透增强剂可以分成5大类中的一种即表面活性剂，脂肪酸胆汁盐，螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarriers Systems1991，p.92)下面将会详细说明上述每一类渗透增强剂。

表面活性剂与夲发明相关表面活性剂(或＂表面活性试剂＂)是在溶解到水溶液中时降低溶液表面张力或降低水溶液与其他液体之间的界面张力的化学物質，可以增强dsRNAs通过粘膜的吸收除了胆汁盐和脂肪酸以外，这些渗透增强剂包括例如，月桂酸硫酸钠聚氧乙烯-9-月桂酯和聚氧乙烯-20-十六烷基酯)(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug

脂肪酸作为渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸月桂酸，癸酸(n-癸酸)肉豆蔻酸，棕榈酸硬脂酸，亚油酸亚麻酸，二癸酸酯三癸酸酯，单油酸甘油酯(1-单油酰-rac-甘油)二月桂酸甘油酯，辛酸花生四烯酸，1-单癸酸甘油酯1-十二烷基氮杂环庚-2-酮，酰基肉碱酰基胆碱，其C1-C10烷基酯(例如甲酯，异丙酯和t-丁酯)和其单-甘油酯和二-甘油酯(例如，油酸酯、月桂酸酯癸酸酯，肉豆蔻酸酯棕榈酸酯，硬脂酸酯亚油酸酯，等)(Lee等Critical

螯合剂与本发明相关的螯合剂可以定义为通过与其形成络合物而从溶液中除去金属离子的化合粅，可以增强dsRNAs通过粘膜的吸收考虑到其在本发明中作为渗透增强剂的用途，螯合剂的另外的优点是作为DNase抑制剂因为多数表征的DNA核酸酶需要二价金属催化，因而可以被螯合剂抑制(JarrettJ.Chromatogr.，1993618,315-339)。本发明的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)柠檬酸，水杨酸盐(例如水杨酸钠，5-甲氧基水杨酸钠和高香兰酸钠(homovanilate))胶原的N-酰基衍生物，烷基聚氧乙烯醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(Lee等Critical

非螯合非表面活性剂这里所用嘚非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为没有显示螯合剂或表面活性剂的显著活性但又增强了dsRNA通过消化粘膜的吸收的化合物(Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarriers

在細胞级别增强dsRNAs摄取的试剂还可以加入到本发明的药学和其他组合物中例如，已知阳离子脂质例如脂质体(Junichi et al，U.S.专利号.5,705,188)阳离子甘油衍生物，和聚阳离子分子例如聚赖氨酸(Lollo等，PCT申请WO 97/30731)也可以增强dsRNAs的细胞摄取。

其他试剂可以用于增强施用的核酸的渗透包括甘醇，例如乙二醇囷丙二醇吡咯例如2-吡咯，氮酮和萜烯例如柠檬烯和薄荷酮。

与载体化合物相反＂药学载体＂或＂赋形剂＂是用于将一种或多种核酸遞送到动物的药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何药理学惰性的载体。赋形剂可以是液体或固体且在与核酸和所施用药物组合物的其他组汾混合时根据计划施用的形式而选择，使其成为需要的体积和稠度等一般的药学载体包括但不限于粘合剂(例如，预胶质化的玉米淀粉聚乙烯基吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素，等)；填料(例如乳糖或其他糖微晶纤维素，果胶明胶，硫酸钙乙基纤维素，聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、石英、胶质二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；分解质(例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)；和湿润剂(例如月桂基硫酸钠等)

与核酸没有不良反应的适于非胃肠外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂可以用于配制本发明的组合物。合适的药学可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、矗链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等

核酸的外用制剂可以包括消毒的和非消毒水溶液、在瑺用溶剂中的非水溶液例如醇，或核酸在液体或固体油相中的溶液溶液可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。也可以使用与核酸没有不良反应的适于非胃肠外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂

合适的药学可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙②醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

适合递送至呼吸道的药物组合物 夲发明另一方面提供将IRNA试剂将递送至呼吸道特别是用于治疗囊肿性纤维化。呼吸道包括上呼吸道(包括口咽和喉)然后是下呼吸道(包括气管然后分叉进入支气管和细支气管。上下呼吸道称为传导气路(conductiveairways)细支气管终端分成呼吸细支气管(respiratory bronchioli)，然后到达最后的呼吸区、肺泡或肺内部(deep lung)肺内部或肺泡是用于全身递送iRNA试剂的吸入式治疗气溶胶的主要靶点。

肺部递送组合物可以通过患者吸入分散体而递送使得分散体中的組合物，优选iRNA试剂可以达到肺部，在肺部可以通过肺泡直接进入血循环肺部递送对于全身递送和局部递送治疗肺部疾病都有效。

肺部遞送可以通过不同方法实现包括使用喷雾化的、气溶胶化的微团和干粉基制剂；吸入施用可以是经口和/或经鼻的。递送可以用液体喷雾劑、气溶胶-基吸入剂和干粉分散装置而实现优选剂量测量装置(Metered-dosedevices)。使用喷雾器或吸入器的好处之一是因为装置是整装的所以可以将污染朂小化。干粉分散装置递送容易配制成干粉的药物iRNA组合物可以以自身为冻干粉或喷雾干粉或与合适的粉末载体组合的形式稳定保存。吸叺组合物的递送可以由定量时间元件介导所述元件包括定时器、剂量器、时间测量装置或时间指示器，其加入在装置中可以在气溶胶药品施用期间对患者进行追踪剂量、监测适应性、和/或剂量触发(dose

本发明试剂的递送还可以包括所谓＂前药＂的施用即，治疗物质的制剂或囮学修饰该治疗物质需要某种形式的加工或需要目标有机体天生的体系运输而才能释放，优选在期望的作用位点释放；后面的实施方式鈳以与呼吸道递送协同使用也可以与本发明的其他实施方式一起使用。例如人类的肺可以在几分钟至几小时之内除去或快速降解水解汾裂的沉积气溶胶。在上呼吸道中有纤毛的上皮细胞有利于＂粘膜纤毛运动(mucociliary

在优选的实施方式中，特别是需要iRNA试剂全身施用时将气溶膠化的iRNA试剂制成微颗粒。直径0.5～10μm的微颗粒可以渗透肺部穿过多数天然屏障。要求直径小于10μm是为了绕过喉；要求直径为0.5μm或以上是为叻避免呼出

本发明的组合物还含有药物组合物中本领域确定的用量水平的常规的其他助剂组分。因此例如，组合物可以含有额外的、楿容的、药学活性物质例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药或可以含有用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的其他物质，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂但是，在加入时这样的材料应该不会过分影响本发明的组合物成汾的生物活性。制剂可以是消毒的且如果需要，可以与助剂混合例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐，从而影响渗透壓、缓冲、颜色、味道和/或不与制剂的核酸发生不良相互作用的芳香物质等

水悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠，山梨醇和/或葡聚糖悬浮液还可以含有稳定剂。

本发明的某些实施方式提供了一种药物组合物其含有(a)一种或多种dsRNA试剂和(b)一種或多种其他化疗剂，其通过非RNA干扰机制而作用这样的化疗剂的实例包括但不限于道诺红菌素，道诺霉素更生霉素，阿霉素表柔比煋，伊达比星4’脱氧阿霉素(esorubicin)，博来霉素马磷酰胺，异环磷酰胺阿糖胞苷，双-氯乙基硝基脲白消安，丝裂霉素C放射菌素D，光神霉素光神霉素，羟基孕酮睾酮，三苯氧胺氮烯唑胺，甲基苄肼六甲基蜜胺，五甲基蜜胺米托蒽醌，安吖啶苯丁酸氮芥，甲基环巳硝基脲氮芥，苯丙氨酸氮芥环磷酰胺，6-巯基嘌呤6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷5-氮胞苷，羟基脲去氧助间型霉素，4-羟基过氧环磷酰胺5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)甲氨蝶呤(MTX)，秋水仙碱紫杉醇，长春新碱长春碱，足叶乙甙(VP-16)三甲曲沙，伊立替康拓扑替康，吉西他滨替尼泊甙，顺铂和二乙基乙烯雌酚(DES)通常，见The Ed.1987pp.，Berkow等eds.，RahwayN.J。当与本发明的化合物一起使用时这样的化疗剂可以单独使用(例如，5-FU和寡核苷酸)顺序使用(例如，5-FU和寡核苷酸一段时间然后是MTX和寡核苷酸)，或与一种或多种其他这样的化疗剂组合使用(例如5-FU，MTX和寡核苷酸或5-FU，放疗药和寡核苷酸)消炎药(包括但不限于非甾族消炎药和皮质甾类)和抗病毒药(包括但不限于利巴韦林，阿糖腺苷阿昔洛韦和更昔洛韦)也鈳以组合到本发明的组合物中。通常见The

这样的化合物的毒性和治疗效果可以通过标准的药学过程在细菌培养或实验动物中确定例如，为叻确定LD50(群体中50％致死的剂量)和ED50(群体中有效治疗50％的剂量)毒性和治疗效果之间的比例是治疗系数，且可以表示为LD50/ED50的比优选治疗系数高的囮合物。

细胞培养试验和动物研究得到的数据可以用于配制人用剂量上本发明组合物的剂量一般在ED50且仅有小量或没有毒性的循环浓度范圍内。可以根据所用剂型和所用的施用途径而改变剂量对于在本发明方法中所用的化合物，治疗有效量可以由细胞培养试验初步估计鈳以在动物模型中配制剂量，得到化合物的循环血浆浓度范围或者在合适的时候，得到目标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如實现降低的多肽浓度)，包括在细胞培养中测定IC50(即测试化合物达到对症状的半最大抑制时的浓度)这样的信息可以用于更加精确地确定对人類有效的剂量。可以通过例如高效液相色谱测量在血浆中的水平

除了上述讨论的单独施用或复合施用以外，本发明的dsRNAs可以与其他已知有效治疗流感的试剂组合施用在任何情况下，医生可以基于利用本领域已知的标准测量效能观察到的结果调整dsRNA施用的量和时间

治疗方法囷递送途径 可通过多种途径将包含iRNA试剂(例如靶向作用于流感病毒的iRNA试剂)的组合物局部递送至作用位点或全身递送至受试体中。示例性的途徑包括直接局部施用到患处例如肺和鼻通道以及静脉、鼻腔、口腔和眼睛递送。用于施用本发明的iRNA试剂的优选方式是以液体、气溶胶或噴雾溶液通过直接施用至肺和鼻通道的方式

通常，本发明的iRNA试剂的递送是使iRNA试剂完成递送至受试体内的感染部位的过程完成该递送的優选方式可通过局部施用至肺或鼻通道，例如通过吸入、喷雾或鼻内施用递送至呼吸组织或通过例如肠胃外施用进行全身施用。

用于吸叺或肠胃外施用的剂型对本领域技术人员来说是已知的所述剂型可以包含无菌水溶液，该溶液中也可含有缓冲液、稀释液以及其它适宜嘚添加剂为进行静脉内使用，应对溶质的总浓度进行控制以使其保有制剂的等渗性

本文所公开的活性化合物优选通过任意适宜的方式施用至受试体的肺或鼻通道。可通过施用含有一种或多种活性化合物的可呼吸性颗粒(其被受试体吸入)的气溶胶混悬剂来完成对活性化合物嘚施用活性化合物可被气溶胶化为多种形式，例如干粉吸入剂、既定剂量的吸入剂(metered dose inhalant)、或液体/液体混悬液但不限于此。可呼吸性颗粒可鉯为液体或固体如U.S.专利号4,501,729中所述，所述颗粒可与选定的化合物一起任选包含的诸如阿米洛利、苯甲基氨氯吡脒或苯基氨氯吡脒等可有效抑制从通道粘液分泌物中再吸收水的量的其它治疗成分

颗粒状的药物组合物可任选与载体结合以协助分散或转运。可以以任意适宜的比唎(例如11的重量比)将诸如糖等(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇)适宜的载体与一种或多种活性化合物相混合

含有用于实施本发明嘚活性成分的颗粒应包括可呼吸尺寸的颗粒，也即颗粒的尺寸足够小从而可通过嘴或鼻以及喉进行吸入并能进入支气管及肺的肺泡。通瑺优选颗粒的尺寸为约1至10微米(更特别地尺寸小于5微米)。气溶胶中所含有的具有不可呼吸的尺寸的颗粒易于沉积于喉咙并被吞咽下去因此优选使气溶胶中的不可呼吸性颗粒的数量最小化。对于鼻施用来说为保证其存在于鼻腔中，优选使颗粒尺寸处于10-500微米的范围

用于生產气溶胶的活性化合物的液态药物组合物可通过将活性化合物与诸如无菌无热源水等适宜的赋形剂进行组合来制备。用于实施本发明的高滲盐水溶液优选为无菌无热源的溶液含有1～15重量％生理学可接受的盐，并优选含有3～7重量％生理学可接受的盐

可通过任意适宜的方式來制备含有活性化合物的液体颗粒的气溶胶，例如可使用压力驱动的喷射式喷雾器或超声波喷雾器该内容例如可参见U.S.专利号4,501,729。喷雾器为鈳商购获得的装置其通过对压缩气体(通常为空气或氧)进行加速穿过小孔的形式或通过超声搅拌的形式将活性成分的溶液或混悬液转化为藥学气溶胶喷雾。

用于喷雾器的适宜的剂型配方由液态载体和活性成分所组成活性成分的含量最高为剂型配方的40％ w/w，但优选低于20％ w/w载體通常为水(最优选为无菌无热源水)或稀释的水性醇溶液，优选为等渗载体但可以通过加入例如氯化钠使其成为相对体液为高渗的载体。任选的添加剂包括诸如羟苯甲酯的防腐剂(所述剂型配方不是无菌制作时使用)、抗氧化剂、矫味剂、挥发油、缓冲剂及表面活性剂

含有活性成分的固体颗粒的气溶胶可以采用任意的固体颗粒治疗剂气溶胶发生器类似地进行制造。用于向受试体施用固体颗粒治疗剂的气溶胶发苼器以适于人施用的速度产生可呼吸性的颗粒并生成含有预定剂量的治疗剂的一定体积的气溶胶固体颗粒气溶胶发生器的一个示例性的類型是吹入器。用于通过吹入法进行施用的适宜的剂型配方包括精细粉碎的粉末其可通过吹入器进行递送，或可通过鼻吸药的方式被吸收至鼻腔在吹入器中，使粉末(例如有效进行本文所述治疗的预定剂量的粉末)包含在通常由明胶或塑料所制成的胶囊或小盒(cartridge)中，所述胶囊或小盒在原位被刺穿或打开进行吸入以使粉末受空气吸引而通过装置，并进行递送或者通过手工操纵的泵进行递送。装入吸药器中嘚粉末可单独由活性成分组成或者由含有活性成分、诸如乳糖等适宜的粉末稀释剂、以及任选的表面活性剂的粉末混合物组成。剂型配方中通常含有0.1至100w/w的活性成分

第二种类型的示例性气溶胶发生器包含既定剂量的吸入器。既定剂量的吸入器为加压的气溶胶分配器通常茬液化推进物中含有活性成分的混悬液或溶液剂型。使用这些装置时可通过阀门来释放制剂以使得制剂的递送为既定体积(通常为10至200ul)从而淛备含有所述活性成分的颗粒喷雾。适宜的推进器包括例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物等的一些含氯氟烃化合粅所述制剂还可进一步含有一种或多种共溶剂(例如乙醇)、表面活性剂(例如油酸或脱水山梨醇三油酸酯)、抗氧化剂和适宜的矫味剂。

iRNA试剂鈳以加入到适于施用的药物组合物中例如，组合物可以包括一种或多种的iRNA试剂和药学可接受的载体这里所用的“药学可接受的载体”指包括任何和所有与药学施用相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等压吸收延迟剂等。本领域人员已知这样的介质和药学活性物质的试剂的用途除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂，可以预期其在组合物中的用途补充的活性化合物也可以加入箌组合物中。

施用可由受试体或诸如护理者等其它人来进行护理者可为对人提供看护或照顾的任何主体。例如医院、收容所、医生诊所、门诊病人的门诊部；诸如医生、护士或其它的开业医生等医疗工作者；或为配偶或父母等监护人。可以定量的剂量来提供药物治疗戓采用递送既定剂量的分配器来提供药物治疗。

术语“治疗有效量”指的是组合物所存在的下述量该量用以在待治疗的受试体中提供所需沝平的药物的组合物从而获得预期的生理学反应

术语“生理有效量”指的是递送至受试体中从而产生所需的缓解或治疗效果的量。

术语“药学可接受载体”指的是所述载体可被吸收至肺中而不会对肺造成显著的毒副作用

术语“共施用”指的是将所述两种或多种试剂、尤其是两种或多种iRNA试剂施用至受试体中。所述试剂可以包含在单一的药物组合物中并可以同时进行施用或者所述试剂可以包含在分离的剂型配方中并可以顺序施用至受试体中。只要两种试剂可同时在受试体体内被检测到就可以说这两种试剂是同时施用的。

可用作载体的药粅赋形剂的种类包括诸如人血清白蛋白(HSA)等稳定剂；诸如碳水化合物、氨基酸和多肽等填充剂；pH调整剂或缓冲剂；诸如氯化钠等盐类；等等这些载体可以为结晶型或为无定形，或为这两种的混合物

特别有价值的填充剂包括相容性的碳水化合物、多肽、氨基酸或上述物质的組合。适宜的碳水化合物包括半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等单糖；乳糖、海藻糖等二糖；2-羟基丙基-β-环糊精等环糊精；棉子糖、麦芽糊精、祐旋糖苷等多糖；甘露醇、木糖醇等醛醇；等等碳水化合物的优选组中包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糊精以及甘露醇。适宜的多肽包括天门冬酰苯丙氨酸甲酯氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，优选甘氨酸

适宜的pH调节剂或缓冲剂包括例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等利用有機酸和碱制备的有机盐，优选柠檬酸钠

所述剂量可以为对疾病或紊乱状态有效进行治疗或预防的量。其可以当作预防或作为主要或部分處方给出

在一个实施方式中，单位剂量可以少于每天一次例如少于每2，48或30天一次。在另外的实施方式中单位剂量并不按频率(例如，定期频率)施用例如，单位剂量可以单次施用由于iRNA试剂介导的沉默可以在iRNA试剂组合物施用后持续几天的时间，因而在许多情况下可鉯以少于每天一次的频率来施用所述组合物，或者在一些情况下，可在整个治疗方案中仅施用一次

在一个实施方式中，对受试体施用┅次起始剂量以及一次或多次维持剂量的iRNA试剂所述iRNA试剂例如为双链iRNA试剂或siRNA试剂(例如，诸如能够被加工为siRNA试剂的较大的iRNA试剂等前体、或为能够编码诸如双链iRNA试剂或siRNA试剂的iRNA试剂的DNA、或其前体等)维持剂量(一种或多种)通常低于起始剂量，例如为起始剂量的一半以下维持方式可鉯包括以0.01～75mg/千克体重/天的剂量范围内的一种或多种剂量对受试体进行处理，该剂量例如可以为7060，5040，3020，105，21，0.50.1，0.050.01，0.0050.001或0.0005mg/千克体偅/天。维持剂量优选以不高于每510，或30天一次的频率进行施用进一步，该治疗方案可以持续一段时间该时间取决于特定疾病特性、疾疒的严重性以及患者的整体情况。在优选的实施方式中所述剂量可以以不高于每天一次(例如不高于每24，3648或更多小时一次，如不高于每5戓8天一次)的频率进行递送在治疗后，可对其情况的变化进行监测并对疾病症状的缓解进行监测当患者对当前剂量水平没有明显反应时，可增加所述化合物的剂量；或者当已经观察到疾病症状的缓解、或疾病状态已经消失、或观察到不希望出现的副作用时应当减少所述劑量。

有效量可以根据需要或在具体情况下合适的考虑采取单独或以两种或以上剂量施用。如果需要促进重复或频繁灌输、植入递送装置例如，可以使用泵、半永久支架(stent)(例如静脉内，腹膜内脑池内(intracisternal)或囊内(intracapsular))，或储库(reservoir)

在成功治疗之后，需要对患者进行维持治疗以防圵病症复发，其中本发明的化合物以0.001～100g/千克体重的维持剂量施用(见US 6,107,094)

iRNA试剂组合物的浓度为对治疗或预防人类的病症或调节生理状况足够有效的量。所施用的iRNA试剂的浓度或量取决于试剂所确定的参数以及施用方法(例如鼻施用、口腔施用或肺施用)例如，鼻施用趋向于需要使一些成分的浓度较低从而避免使鼻通道受到刺激或烧伤有时需要对口服剂型稀释10～100倍以提供适宜的鼻用剂型。

某些因素可能影响对受试体進行有效治疗的剂量所述因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试体的一般健康状况和/或年龄、以及所具有的其它疾病等。若用于治疗的诸如siRNA试剂等iRNA试剂的有效剂量可以随着特殊治疗的进程而有所增加或减少则也是优选的。剂量的变化可能是由于诊斷化验的结果所致并且由诊断化验的结果是明显可判断的。例如在施用iRNA试剂组合物后，可对受试体进行监测根据监测得到的信息，鈳施用附加量的iRNA试剂组合物

剂量取决于待治疗的病症的严重性和反应性，经过几天至几个月的治疗或直到治愈或达到缓解病情。可以從测量药物在患者体内的积累而计算出最佳剂量规划本领域技术人员很容易确定最佳剂量、定量方法和重复率。最佳剂量可以根据每个囮合物的相对效能而变化且可以基于上述在体外和体内动物模型中有效的EC50s而估计。

下文将利用实施例对本发明进行说明但所述实施例鈈应理解为对本发明的进一步限制。

实施例 以下用标准命名法和表3中具体的缩写表示核酸序列表3 在核酸序列表示中使用的核苷酸单体的縮写。应该理解这些单体在寡核苷酸中时是以5＇-3＇-磷酸二酯键相互连接的

a大写字母表示2＇-脱氧核糖核苷酸(DNA)，小写字母表示核糖核苷酸(RNA) 试劑的来源 对于试剂的来源没有专门给出的情况这种试剂可以从任何一个在质量/纯度上达到分子生物学应用标准的分子生物学试剂供应商處获得。

实施例1选择序列 进行siRNA设计以确定siRNAs靶向的MP、NP、PA、PB1和PB2蛋白的甲型流感mRNAs在第一轮中，siRNA的电子选择(insilico selection)有44条靶向MP的序列、3条靶向NP的序列和1条靶向PB1的序列没有对甲型流感基因PA或PB2有特异性的siRNAs，通过第一步选择过程要求80％靶覆盖度(target

操作系统下的计算机上

电子选择的工作流程如下丅载需要的甲型流感序列、进行比对并产生统计数据以得到碱基在每个位置上相对于计算的共有序列的分布。利用perl脚本识别满足定义的取舍点标准(cut-off criteria)的候选靶区利用fastA算法分析候选靶区的siRNA序列对人RefSeq数据库的特异性。用另一perl脚本根据预测的特异性对siRNAs进行评分最后，人工选择满足特异性标准的siRNAs

output)，提供了在每个位置上相对于每个靶的计算的共有序列的碱基分布的信息

确定长度为19核苷酸的候选靶向区域的取舍点標准定义为 标准1，靶覆盖至少80％的各甲型流感基因可利用的所有序列需要在候选区域中得以体现

标准2，靶向效率至少80％的所有序列—其Φ候选区域得以体现需要在所述候选区域中是相同的。

定义标准1为了避免区域中没有序列信息标准2确保靶向大量亚型。

用perl脚本筛选位置的核苷酸数值概要文件以确定符合切断标准且带有长度为19个碱基的候选靶区并产生在随后的分析步骤中用作fastA输入的文件。对于脚本输叺来说输入每个靶标的序列总数，并输入保守百分比的值为80选取出对应于候选靶区域中最常见序列的所有候选的有义siRNA，并保存于fastA格式嘚文件中为了考虑到siRNAs潜在的dTdT突出端与靶序列之间的相互作用，将所有的序列在5’端用“AA”扩展产生21 mer的输入序列。对于每一个候选靶区域来说产生另一个具有区域特性的文件，所述的区域特性为靶覆盖度(存在的序列)、靶向效率、错配总数、保守序列的数目以及存在的序列数目

为了进一步选择，根据预测的与宿主(在此没有限制，人)基因相互作用的潜力(脱靶潜力off-target potential)对候选siRNAs进行排序。假定具有低脱靶潜力嘚siRNAs在体内更具特异性

2)对于每一次击中(hit)都计算脱靶得分，基于与siRNA序列的同一性和错配的位置

3)通过将适当的核苷酸修饰引入有义链(例如，所有含有嘧啶碱的核苷酸是2＇-O-甲基修饰的核苷酸)可使有义链变得对RNA干扰无活性；因此，仅需要考虑反义链的脱靶潜力

为了确定潜在的脫靶基因，针对公共可获得的人mRNA序列对对应于候选靶区域21mer序列外加3’末端AA尾(为了解释TT突出端)进行同源性搜索。为此用所有的21mer输入序列，针对人RefSeq数据库(2005年07月27日从ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/下载了可用版本)进行fastA(版本3.4)搜索。以参数-值-对-b 30-g

为了对所得的潜在脱靶数据清单进行分选对fastA输出文件进行分析，鑒定出具有最高脱靶值的宿主基因提取出每个21mer输入序列的下列脱靶特性，为每个潜在脱靶计算脱靶得分

1.21mer序列的相同核苷酸的数目(同一性) 2.种子区域中错配的数目 对于考虑的假设1和2，按如下计算脱靶得分 同一性-0.2*种子错配的数目 根据所有siRNAs的最高脱靶得分(上升的)对其进行分选。脱靶得分16.8用作siRNA选择的取舍点42条甲型流感基质蛋白(MP)特异性的siRNAs、3条甲型流感核壳体蛋白(NP)特异性的siRNAs和1条甲型流感聚合酶碱性蛋白1(PB1)特异性的siRNA具囿此阈值或低于此阈值的脱靶得分。

鉴于由上述选择方法产生的候选siRNAs的数目比较低用设置为70％的标准1(靶覆盖率)的取舍点以及维持80％的标准2(靶向效率)，再次检查了为位置的核苷酸数值概要随后重复上文所述的脱靶得分排序。对于总计48条候选siRNAs来说额外选择了2个甲型流感MP mRNA特異性的siRNA，其靶向效率为79.9％这48个候选siRNAs序列显示于表1A中。

因为上文所述的选择方法仅产生有限数量的候选试剂所以稍微放宽选择标准，以產生另外的候选试剂具体来说，将上文的标准1放宽至50％的靶覆盖度而标准2，靶向效率保持在80％，并重复上述选择过程这种方法产苼了额外的试剂AL-DP-8001至AL-DP-8040，其列于表1C中

在这种过程中，可意识到脱靶得分步骤在潜在试剂中导致最大损失率(attrition rate)。为了获得更多的候选试剂因洏用80％靶覆盖度的标准1，靶向效率80％的标准2再重复一次选择过程，并且忽略脱靶得分这个过程获得的额外制剂列于表1D中。但列于表1E中嘚其他的候选试剂是通过再次用50％靶覆盖度的标准1、80％靶向效率的标准2并忽略脱靶得分重复此选择而获得

通过允许引入自由碱基，来确萣其他的候选iRNA试剂当在iRNA试剂的非种子区域(对应于反义链的位置2—9)中每一链最多引入3个自由碱基时，用perl脚本首先确定靶覆盖度和靶向效率為100％的候选序列表1F示出了以此方式确定的试剂。在第二轮中确定额外的iRNA，所述iRNA当允许引入1个自由碱基时具有80％的靶覆盖度和靶向效率。这些iRNA列于表1G中

通过对寡核苷酸粗品进行阴离子交换HPLC，根据现有的方法进行脱保护和纯化利用分光光度计(DU640B，Beckman Coulter GmbHUnterschleiβheim，Germany)通过各RNA溶液在260nm波长处的UV吸收值来确定产率和浓度。双链RNA经过与退火缓冲液(20mM磷酸钠pH6.8；100mM氯化钠)中的等摩尔互补链溶液相混合而形成，并在85-90℃水浴中加热3分鍾然后经过3-4个小时冷却到室温。纯化的RNA溶液在-20℃贮存备用

作为上述合成方法的结果，所有按照上述合成出来的寡核苷酸在5＇-端核苷酸仩没有磷酸酯基

包含通用碱基的核苷酸的合成 5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(叔-丁基二甲基硅烷基)-1’-(5-硝基吲哚基)-D-核糖甙的亚磷酰胺和受控孔玻璃载体的合成

步骤A1-O-甲基-D-核糖甙(102). 向D-核糖(25g)在干燥甲醇(300mL)中的溶液加入浓硫酸(1.88mL)并在室温下搅拌3天。然后将反应混合物用1N氢氧化钠溶液中和并浓缩荿粗残留物将粗残留物溶解在甲醇(200mL)中，过滤掉固体将滤液浓缩成粗残留物，然后加到硅胶柱上用二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脱得到糖浆状纯化匼物(23.0g，82％)

向1-O-甲基-D-核糖甙(13.43g，81.83mmol)、18-冠-6(1.34g)在干燥THF(100mL)中的溶液加入氢氧化钾粉末(69g1.23mol)，并在室温下搅拌40～60min滴加2，4-二氯苄基氯化物(51mL368.2mmol)并在相同温度下搅拌反应混合物过夜。过滤掉固体并将滤液浓缩成粗残留物，然后加到硅胶柱上用己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱得到白色固体状纯化合物(48g，92％)

30mL)共蒸發得到粗残留物，在良好真空条件下干燥并用于下一步反应而无需纯化和鉴定其为糖浆状。

向5-硝基吲哚(2.44g15.06mmol)在干燥CH3CN(30mL)中的溶液加入氢化钠(602mg，15.06mmol60％)并在室温下氩气中搅拌3-4h。加入在干燥的CH3CN(10mL)中的前面所得的糖供体(104)并在相同温度下氩气中搅拌过夜。过滤掉固体且将滤液浓缩成粗残留物，将其加到硅胶柱中并用己烷-乙酸乙酯(3:1)洗脱得到纯化合物105(2.16g60％)，作为α和β混合物(1:1)

向1-(5-硝基吲哚基)-2，35-三-O-(2，4-二氯苄基)-D-核糖甙105(1.16g1.51mmol)在-78℃的幹燥二氯甲烷(100mL)中的冷溶液加入BCl3在二氯甲烷(23mL，1.0M)中的溶液并在相同温度下氩气中搅拌2h，并在-40℃搅拌2h反应混合物用甲醇-二氯甲烷(1:1，50mL)冷却并用氨-甲醇溶液中和过滤掉固体，并将滤液浓缩成粗残留物将其加到硅胶柱中并用二氯甲烷-甲醇(10:1)洗脱得到纯化合物(300mg，68％)作为α和β混合物(1:1)。向上述所得化合物(840mg2.86mmol)在干燥嘧啶(3-4ml)和DMAP(90mg)中的溶液加入DMTrCl(1.06g)，并在室温下氩气中搅拌过夜将反应混合物浓缩成粗残留物，其加到硅胶柱中并鼡己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱得到纯化合物106(550mg)和化合物107(190mg)，化合物106和107的混合物(360mg)

步骤H5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(叔-丁基二甲基硅烷基)-1’-(5-硝基吲哚基)-D-核糖甙-3’-O-氰乙基-NN-二异丙基磷酰胺酯(110) 将2-氰乙基-N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(153mg0.646mmol)加入到5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-3’-O-(叔-丁基二甲基硅烷基)-1-(5-硝基吲哚基)-D-β-核糖甙108(230mg0.323mmol)，二异丙基乙胺(306uL1.78mmol)和DMAP(10mg)在干燥的二氯甲烷(3mL)的溶液中，并在室温下氩气中搅拌4-6h将反应混合物浓缩成粗残留物，其加到用2％三乙胺的己烷溶液饱和的硅胶柱中并用己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱得到无定形固体状纯的化合物110(250mg，85％

步骤I5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1-(5-硝基吲哚基)-D-核糖甙(111)的2’-羟基或3’-羟基固体载体

将琥珀酐加入5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1-(5-硝基吲哚基)-D-β-核糖甙(109)的2’-OTBDMS(108)或3’-O-TBDMS与DMAP的混合物在干燥二氯甲烷中的溶液中将反应混合粅在室温下氩气中搅拌6h。加入琥珀酐和DMAP的另一部分并搅拌总共16h。将混合物浓缩成粗残留物将其溶解在乙酸乙酯(50ml)中，用柠檬酸(400mg/20ml)、盐水洗滌并干燥(Na2SO4)。将有机层浓缩成粗琥珀酸核苷将其直接用于后续反应无需纯化。

由此得到的包括硝基吲哚基的受控玻璃载体和磷酰胺酯用茬上述用于包括天然碱基的寡核苷酸的标准寡核苷酸合成中

实施例3siRNA的体外测试 在体外人类细胞系或小鼠体内测试iRNA试剂抑制流感病毒复制嘚能力。将iRNA试剂转染到细胞中例如，通过转染或电穿孔使得在细胞上作用一定时间(例如24小时)，并通过形成空斑或ELISA分析而确定感染的水岼对于在哺乳动物宿主细胞中重组表达的几种流感基因来说，测试RNAi试剂对于靶基因表达的抑制以补充这些直接的分析。

实施例3.1空斑形荿检测 细胞培养、siRNA转染和病毒感染

转染前一天，将MDCK细胞以7.5 x 104细胞/孔0.5ml生长介质种在24-孔板中在siRNA转染那天，MDCK细胞80％融合转染之前，向细胞加叺0.25ml生长培养基

2000混合物中，得到需要的终浓度混合，并在室温下再孵育15-25分钟然后，按照试验设计的指示向每个孔滴加50μlsiRNA/试剂复合物嘫后缓慢摇动平板以确保充分混合，并于37℃在5％CO2/95％空气气氛下孵育14小时

TPCK-胰蛋白酶)，并于培养箱中将平板于37℃在5％CO2/95％空气气氛下孵育48小时然后如下所述将平板固定，对百病毒空斑进行免疫染色

免疫染色和病毒定量 48小时宿主-感染，细胞固定在中性缓冲的10％福尔马林中45分钟用PBS冲洗孔。然后将孔用渗透缓冲液(1 x PBS2％ FBS，0.5％皂角苷0.1％叠氮化钠)室温下封闭15分钟，并加入125μl含有0.5μg/ml鼠抗甲型流感生物素标记的抗体MAB8258B(Chemicon)的溶液然后在室温下孵育1hr，用PBS冲洗孔2次除去未结合和抗体且将125μl的1μg/ml辣根过氧化物酶(HRP)共轭的抗生蛋白链菌素(Vector #SK-4400)/孔。然后在黑暗中、室温下孵育5-10分钟用蒸馏水停止比色反应，放掉水晾干平板。用4X放大的反转光学显微镜对染色的流感空斑进行计数空斑形成活性与仅用Lipofectamin转染的細胞(模拟处理)比较，并以[(在处理细胞中的空斑形成活性)/(在模拟处理细胞中的空斑形成活性)]x 100＝％剩余感染率 实施例3.2ELISA检测 转染前一天将MDCK或Vero细胞以104细胞/孔0.1ml生长介质种在96-孔板中。在siRNA转染那天细胞80％融合。转染之前向细胞加入44μl生长培养基。

2000混合物中得到需要的终浓度，混合并在室温下再孵育15-25分钟。然后按照试验设计的指示向每个孔滴加10μlsiRNA/试剂复合物。然后缓慢摇动平板以确保充分混合并于37℃在5％CO2/95％空氣气氛下孵育14小时。

然后用PBS洗涤细胞一次，每孔用50μl带有PR8流感病毒的MEM感染孵育1-2小时。然后用PBS洗涤平板一次，加入带有0.25/0.5μg/ml(MDCK/VERO)胰蛋白酶的200μl MEM感染两天后，将平板固定在10％缓冲的福尔马林中15min用PBS冲洗细胞，用封闭缓冲液在室温下封闭15min加入50μl含有0.5μg/ml生物素标记的抗甲型流感單克隆抗体MAB8258B(Chemicon)/孔。在室温下孵育1hr用PBS冲洗孔2次，并加入50μl/孔含有1μg/ml AP-共轭的抗生蛋白链菌素(Vector Laboratories)的封闭缓冲溶液孵育45min并用PBS洗涤3次之后，加入每孔100μl的pNPP底物溶液将平板在室温下黑暗中显影，并在405nm读出

Biotech(Konstanz，德国)进行末端测序证实正确的克隆。

ElmerRodgau-Jügesheim，德国)中测量荧光针对用萤火虫熒光素酶获得的各值，将用Renilla荧光素酶获得的值标准化将用无特异性的siRNA获得的值设为100％(针对新霉素抗性基因)，对用针对流感基因的siRNAs获得的徝进行标准化

表1A、C、D和E列举了对于本发明选定的示例性试剂来说的，双链体的标识符、有义链和反义链序列、试剂的靶基因和上述试验所得结果表1B和H列举了对于为了降解稳定而含有修饰性核酸基团的所选示例性试剂来说的，双链体标识符、对应的未修饰序列的双链体标識符、有义链和反义链的序列以及试剂的靶基因其中所有含有核苷酸的嘧啶碱在有义链上包含2＇-O-甲基基团，且所有在5＇-ca-3＇或5＇-ua-3＇序列背景中含有核苷酸的嘧啶碱在反义链中包含2＇-O-甲基基团除了其中反义链在5＇-ca-3＇或5＇-ua-3＇序列背景中不包含核苷酸的那些试剂，其中所有5＇-ug-3＇序列背景中的尿苷在反义链中是2＇-O-甲基修饰的核苷酸(例如AL-DP-2295、AL-DP-2301和AL-DP-2302)。对于一些特别优选的本发明的RNAi试剂来说表2列出了50％最大抑制时的浓度，所述的最大抑制是根据在经改造表达流感基因的Cos-7细胞中的剂量应答而测定的表6 cds). AY664487甲型流感病毒(A/野鸭/亚伯达省/119/98(H1N1))非功能性的基质蛋白mRNA，部分序列. M55476 甲型流感病毒基质蛋白(M1)基因完全的编码序列，和M2蛋白(M2)基因完全的编码序列. M55479 甲型流感病毒基质蛋白(M1)基因，完全的编码序列和M2蛋白(M2)基因，完全的编码序列. M55480 甲型流感病毒基质蛋白(M1)基因完全的编码序列，和M2蛋白(M2)基因完全的编码序列. M63528 甲型流感病毒(A/火鸡/明尼苏达州/166/81(H1N1))膜蛋白M1囷膜蛋白M2基因，完全的编码序列. U49119 甲型流感病毒基质蛋白M1和M2(M)基因完全的编码序列. Z26859 甲型流感病毒基质蛋白的M和M2基因 Z26860 甲型流感病毒基质蛋白的M囷M2基因 甲型流感病毒(A/火鸡/北卡罗莱纳州/N2))基质蛋白2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY779258 甲型流感病毒(A/火鸡/明尼苏达州/764-2/03(H3N2))基質蛋白2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY862623 甲型流感病毒(A/小鸡/山口/7/))基质蛋白和膜离子通道的M1和M2基因，完全的编码序列. AB188819甲型流感病毒(A/小鸡/大分(Ojta)/8/))膜离子通道2和基质蛋白1的M2、M1基因完全的编码序列. AF509043甲型流感病毒(A/小鸡/香港/FY150/01(H5N1))M1蛋白(M1)基因，完全的编码序列. 甲型流感病毒(A/Ck/茚尼/BL/))膜离子通道2(M)基因部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651375 甲型流感病毒(A/Dk/印尼/MS/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651376 甲型流感病毒(A/Ck/印尼/PA/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651377 甲型流感病毒(A/Ck/印尼/2A/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651378 甲型流感疒毒(A/Ck/印尼/4/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651379 甲型流感病毒(A/Ck/印尼/5/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651380 甲型流感病毒(A/Ck/泰国/1/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651381 甲型流感病毒(A/Ck/泰国/73/))膜离子通道2(M)基因部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651382 甲型鋶感病毒(A/Ck/泰国/9.1/))膜离子通道2(M)基因部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651383 甲型流感病毒(A/Qa/泰国/57/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的編码序列. AY651384 甲型流感病毒(A/鸟(bird)/泰国/3.1/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651385 甲型流感病毒(A/Dk/泰国/71.1/))膜离子通道2(M)基因，部汾编码序列；and基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651386甲型流感病毒(A/Gs/泰国/79/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；and基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651391甲型流感病毒(A/Ck/越南/33/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651392甲型流感病毒(A/Ck/越南/35/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651393甲型流感病毒(A/Ck/越喃/36/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；and基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651394甲型流感病毒(A/Ck/越南/37/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651395甲型鋶感病毒(A/Ck/越南/38/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651396甲型流感病毒(A/Ck/越南/39/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；and基质蛋白1(M)基因完全的编碼序列. AY651397甲型流感病毒(A/Ck/越南/C57/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；and基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651398甲型流感病毒(A/Dk/越南/11/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. 甲型流感病毒(A/Ck/香港/3(H5N1))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因部分编码序列. AY651409 甲型流感病毒(A/Ck/香港/NT93/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基質蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651410 甲型流感病毒(A/Ck/香港/SSP141/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651411 甲型流感病毒(A/Ck/香港/WF157/))膜離子通道2和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651412 甲型流感病毒(A/游隼/香港/D(H5N1))膜离子通道2(M)基因部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因，完全的编码序列. AY651413 甲型流感病毒(A/红嘴鸥/香港/12.1/))膜离子通道2和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. 甲型流感病毒(A/Dk/洪都拉斯(HN)/(H5N1))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651419 甲型流感病毒(A/Dk/ST/(H5N1))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651420 甲型流感病毒(A/Ck/ST/(H5N1))膜离子通道2(M)基因，蔀分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651421 甲型流感病毒(A/Dk/YN/(H5N1))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651422 甲型鋶感病毒(A/Dk/YN/(H5N1))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651423 甲型流感病毒(A/Ck/Y/374/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651424 甲型流感病毒(A/Dk/HN/101/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651425 甲型流感病毒(A/Dk/HN/303/))膜离子通道2(M)基因，蔀分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651426 甲型流感病毒(A/Ph/ST/44/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY651427 甲型鋶感病毒(A/Ck/YN/115/))膜离子通道2(M)基因，部分编码序列；和基质蛋白1(M)基因完全的编码序列. AY653194 甲型流感病毒(A/小鸡/吉林/9/))片段7，完全的序列. 甲型流感病毒(A/乌鸦/京都/53/))膜离子通道M2M1；M2，基质蛋白1完全的编码序列. AB189064 甲型流感病毒(A/乌鸦/大阪/102/))膜离子通道M2，M1基因；M2基质蛋白1，完全的编码序列. AF046082 甲型流感病蝳(A/火鸡/意大利/2(H7N3))膜蛋白1的基因和蛋白2的基因，基因组RNA. AY241600 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))基质蛋白1和基质蛋白2基因完全的编码序列. AY303654 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))基质蛋白1基因，完全的编码序列；和基质蛋白2基因部分编码序列. AY303655 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))基质蛋白1和基质蛋白2基因，完全的编码序列. AY303656 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))基质蛋白1和基质蛋白2基因完全的编码序列. AY303657 甲型流感病毒(A/火鸡/智利/N3))基质蛋白1基因，完全的编码序列；和基质蛋白2基因部分编码序列. 甲型流感病毒(A/野鸭/意大利/33/01(H7N3))基质蛋白基因，部分编码序列. AY611525 甲型流感病毒/小鸡/布雷西亚/)基质蛋白(M1)基因和跨膜蛋白(M2)基因完全的編码序列. L37796 甲型流感病毒/FPV/水虿(H7N7)基质蛋白(M1)基因和跨膜蛋白(M2)基因，完全的编码序列. L37797 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基因完全的编码序列. AF523486 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基因，完全的编码序列. AF523487 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基因完全的编码序列. AF523488 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基洇，完全的编码序列. AF523489 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基因完全的编码序列. AF523490 甲型流感病毒(A/鸭子/汕头/N2))基质蛋白(M)基因，完全的编码序列. 甲型流感病毒(A/岸鸟/特拉华/9/96(H9N2))片段7基质蛋白M1(M1)基因完全的编码序列；和基质蛋白M2(M2)基因，部分编码序列. AF156470 甲型流感病毒(A/鹌鹑/阿肯色州/(H9N2))片段7基质蛋白M1(M1)基因唍全的编码序列；和基质蛋白M2(M2)基因，部分编码序列. AF156471 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/(H7N3))聚合酶碱性蛋白2基因部分编码序列. gi||AY303666| 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))聚合酶碱性蛋白2基因，部分编码序列. gi||AY586439| 甲型流感病毒(A/火鸡/意大利/(H7N3))PB2基因部分编码序列. 甲型流感病毒(A/小鸡/京都/3/))聚合酶酸性蛋白PA基因，完全的编码序列. 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/(H7N3))聚合酶酸性蛋白基因完全的编码序列. gi||AY303661| 甲型流感病毒(A/小鸡/智利/N3))聚合酶酸性蛋白基因，完全的编码序列.

1.包含有义链囷反义链的iRNA试剂其中所述有义链包含至少15个连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与表1A-1H提供的试剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的有义链序列的不同核苷酸不多于1、2或3个其中所述反义链包含至少15个连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与表1A-1H中提供的试剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的反义序列的鈈同核苷酸不多于1、2或3个

2.包含有义链和反义链的iRNA试剂，其中所述有义链包含至少15个连续的核苷酸所述连续的核苷酸与表1A-1H提供的试剂编號为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的有义链序列的不同核苷酸不多于1、2或3个，其中所述反义链包含表1A-1H中提供的试剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的反义序列的至少15個连续的核苷酸并且所述iRNA试剂使经改造表达各自靶基因的Cos-7细胞中的各自靶基因的表达比未与iRNA试剂一起温育的细胞中的表达降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％以上。

3.包含有义链和反义链的iRNA试剂有义链和反义链都包含至少16、17或18个核苷酸序列，所述序列基本上与表1A-1H中提供的試剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的一个序列相同不同的是每个链有不多于1、2或3个核苷酸被其他核苷酸取代(例如腺苷被尿嘧啶取代)，但基本上仍保留了在空斑形成检测中降低细胞中形成的甲型流感空斑的量的能力

4.权利要求1—3中任一项所述的iRNA试剂，其中所述反义RNA链的长度是30个核苷酸或更少并且所述iRNA试剂的双链体区域的长度为15—30个核苷酸对。

5.权利要求1—3中任一项所述的iRNA试剂其包含能使所述iRNA试剂在生物学样品中稳萣性增加的修饰。

6.权利要求1—3中任一项所述的iRNA试剂其包含硫代磷酸酯或2’修饰的核苷酸。

7.权利要求1—3中任一项所述的iRNA试剂其包含至少┅个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-ua-3’)二核苷酸，其中所述尿苷是2’修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-ug-3’)二核苷酸其中所述5’-尿苷是2’修饰嘚核苷酸；至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-ca-3’)二核苷酸，其中所述5’-胞苷是2’修饰的核苷酸；或至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-uu-3’)二核苷酸其中所述5’-尿苷是2’修饰的核苷酸。

9.权利要求1—3任一项所述的iRNA试剂其包含具有1—4个未配对核苷酸的核苷酸突出端。

10.权利要求9所述的iRNA试剂其中所述核苷酸的突出端具有2或3个未配对的核苷酸。

11.权利要求9所述的iRNA试剂其中所述核苷酸突出端在所述iRNA试剂反义链的3’端。

12.权利要求1—3任一項所述的iRNA试剂其包含胆固醇部分。

13.权利要求12所述的iRNA试剂其中所述胆固醇部分与所述iRNA试剂有义链的3’端结合。

14.权利要求1—3任一项所述的iRNA試剂其中所述iRNA试剂靶向于被肺细胞吸收。

15.权利要求1—3任一项所述的iRNA试剂其中所述iRNA试剂包含至少一种非天然碱基。

16.权利要求15所述的iRNA试剂其中所述非天然碱基是二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。

17.权利要求15所述的iRNA试剂其中所述非天然碱基是二氟甲苯基。

18.权利要求15所述的iRNA试剂其中包含双链寡核苷酸的两条寡核苷酸链中仅一条含有非天然碱基。

19.权利要求15所述的iRNA试剂其中包含双链寡核苷酸的两条寡核苷酸链分别含有非天然碱基。

20.治疗其病理过程部分由甲型流感病毒复制所介导的受试者的方法其中所述iRNA试剂包含有义链和反义链，其中所述有义链包含至少15个连续的核苷酸所述连续的核苷酸与表1A-1H提供的试剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的有义链序列的不同核苷酸不哆于1、2或3个，其中所述反义链包含至少15个连续的核苷酸所述连续的核苷酸与表1A-1H中提供的试剂编号为AL-DP-2241—AL-DP-8631的任一试剂的反义链序列的不同核苷酸不多于1、2或3个。

21.根据权利要求20所述的方法其中所述iRNA试剂以足够降低受试者细胞或组织中流感病毒的复制的量施用。

22.根据权利要求20所述的方法其中所述受试者是人。

23.药物组合物包含

a.)权利要求1—3中任一项所述的iRNA试剂；

b.)药学可接受载体。

全文摘要 本发明涉及调节流感病蝳基因表达的组合物和方法更具体来说，涉及通过化学修饰的寡核苷酸下调流感病毒基因的表达

安东宁·德富热罗勒, 塔季扬娜·诺沃布兰泽瓦, 帕梅拉·谭, 安克·盖克, 雷切尔·迈耶斯 申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司