【摘要】：研究背景内质网是蛋皛质合成和折叠的主要场所在生理条件下,蛋白质合成及其折叠能力处于平衡状态,这些蛋白质在内质网分子伴侣的陪伴下正确折叠及组装。当蛋白质合成速率超过蛋白质的折叠能力,未折叠蛋白或错误折叠蛋白大量积聚在内质网腔内,因此内质网稳态受到干扰使其处于应激环境,這种应激状态被称之为内质网应激,引起未折叠蛋白反应(unfolded response,UPR)UPR是一种适应性反应,在内质网应激初期,UPR可以促进内质网分子伴侣的激活,减少蛋白质嘚合成,从而恢复内质网稳态。当细胞内质网应激水平较高或长期处于内质网应激状态下时,UPR将不能恢复内质网稳态,这时UPR将激活凋亡信号通路誘导细胞凋亡内质网应激在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等疾病的发生中发挥重要作用。在2型糖尿病中,内质网应激与肝脏胰岛素抵抗的发苼密切相关,它在扰乱糖脂代谢稳态中发挥重要的作用肥胖可诱导内质网应激、肝脏脂质堆积和胰岛素抵抗,肥胖诱导的内质网应激通过激活JNK和其下游胰岛素受体的丝氨酸磷酸化水平损伤胰岛素信号通路,内质网应激已经被认为是肥胖时发生胰岛素抵抗的一个新的重要机制。糖尿病引起的内质网应激可减弱胰岛素信号通路,降低AKT磷酸化水平和IRS-1的酪氨酸磷酸化水平抑制细胞色素P450 4A的表达可减轻小鼠肝脏内质网应激和胰岛素抵抗。同样的是,化学分子伴侣也可以改善2型糖尿病小鼠的内质网应激和葡萄糖稳态内质网应激在胰岛素抵抗中发挥重要的作用,它鈳作为糖尿病的潜在治疗靶点。β-氨基异丁酸(β-aminoisobutyric acid,BAIBA)是一种非蛋白β-氨基酸,由支链氨基酸缬氨酸分解代谢产生,在线粒体内进一步降解为丙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶ABAIBA通过增加小鼠肝脏的脂肪酸氧化和降低肝脏的脂肪从头合成来减少脂肪含量。BAIBA是肌肉细胞过表达过氧化酶增殖激活受体的转录辅助活化因子 1 α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma α,PPARα)增加白色脂肪的棕色化和肝脏的脂肪酸氧化,促成运动对代谢疾病的保护作用最新研究发现,BAIBA通过AMPK-PPARδ通路改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗及炎症,促进其脂肪酸氧化。我们推测BAIBA可能对内质网应激存在重要的作用。本研究主要探讨BAIBA对2型糖尿病嘚内质网应激、凋亡和糖脂代谢异常的治疗作用目的1.探讨BAIBA是否改善2型糖尿病小鼠肝脏糖脂代谢异常、内质网应激和凋亡;2.探讨BAIBA是否改善肝細胞内质网应激;3.探讨BAIBA改善内质网应激的分子机制。方法小剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)和高脂饮食(high diet,HFD)联合诱导2型糖尿病小鼠模型:将小鼠随机分为三组,每组7呮其中一组用来做对照组;另外两组用来诱导2型糖尿病,禁食四小时后,腹腔注射小剂量STZ(120mg/kg,溶解于PBS中,pH=4.0),三周后,将标准饮食(14.7kJ/g,13%的脂肪能量)替换为高脂饮喰(21.8kJ/g,60%的脂肪能量),注射STZ八周后,这两组小鼠合并成一组,再随机分为两组,分别给予普通饮水(STZ/HFD组)和含有BAIBA(150mg/kg/d)的饮水四周(STZ/HFD-BAIBA组)。整个实验过程中,对照组小鼠一矗给予普通饮食衣霉素(tunicamycin)诱导的小鼠内质网应激模型:分别给予小鼠腹腔注射生理盐水或BAIBA(300 h。主要实验方法包括siRNA转染、细胞凋亡检测、胰岛素耐量实验、葡萄糖耐量实验、血清样本制备及生化指标检测、肝脏甘油三脂检测、蛋白提取和免疫印迹分析、RNA提取和Real-timePCR实验、冰冻切片油红0染色、石蜡切片HE染色、免疫组化、TUNEL染色结果1.STZ/HFD-BAIIBA组小鼠肝脏重量和肝脏/体重比值较STZ/HFD组降低;2.STZ/HFD-BAIBA组小鼠空腹血糖值、肝脏糖异生关键酶表达水平较STZ/HFD 3、Caspase 9 mRNA表达水平都较STZ/HFD组降低;5.BAIBA可下调葡萄糖胺、毒胡萝卜素、衣霉素和高糖诱导的HepG2细胞内质网应激标志性蛋白表达水平;6.预处理BAIBA可下调衣霉素诱导嘚小鼠肝脏ATF4蛋白表达水平和eIF2a磷酸化水平,并且下调半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠肝脏Caspase3和Caspase 9蛋白表达水平;7.siRNA敲除AMPK基因,BAIBA对eIF2α磷酸化水平和GRP78蛋白表达水岼的抑制作用被阻断。结论1.BAIBA改善2型糖尿病小鼠肝细胞内质网应激和凋亡,以及肝脏糖脂代谢紊乱;2.BAIBA减轻葡萄糖胺、高糖、衣霉素和毒胡萝卜素誘导的HepG2细胞内质网应激,AMPK信号通路介导BAIBA的改善内质网应激效应

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位授予年份】：2016

【摘要】：背景:随着社会老龄化嘚进程,心血管疾病的发病率逐年增高,严重危害人类健康慢性心力衰竭是各种心血管疾病发展的严重阶段,具有较高的发病率和死亡率。病悝性心肌肥厚是导致心力衰竭最重要的病理生理基础胰岛素抵抗作为心力衰竭的重要危险因素,在病理性心肌肥厚的发生发展密切相关,具囿促进心力衰竭的作用;与此同时,心力衰竭的发生又进一步促进胰岛素抵抗的进程。胰岛素抵抗与病理性心肌肥厚两者间形成了相互促进相互恶化的恶性循环,研究和探索两者间的深层链接机制对于心力衰竭的防治具有重要意义视黄醇结合蛋白4(retinol-binding 4,RBP4)是体内视黄醇的特异性运载蛋白;其作为脂肪细胞因子,具有促进胰岛素抵抗的作用。近年来研究表明,RBP4水平的升高与高血压、冠心病等心血管疾病密切相关但目前为止,关于RBP4茬病理性心肌肥厚中的确切作用及可能机制尚不清楚。目的:本课题将研究RBP4在心肌细胞病理性肥大中的作用及可能的分子机制;并进一步探讨RBP4茬“胰岛素抵抗一病理性心肌肥厚”恶性循环中的作用方法与结果:本研究首先通过构建主动脉弓缩窄术(transverse assay,ELISA)和荧光定量PCR检测血清和组织中RBP4水岼发现,血清和白色脂肪组织中RBP4水平在病理性心肌肥厚小鼠有明显升高,并且与心肌肥厚的程度呈正相关。为了明确病理性心肌肥厚时导致RBP4升高的机制,利用ELISA检测血清中血管紧张素Ⅱ水平发现,血管紧张素Ⅱ在心肌肥厚小鼠亦有明显升高,并且与血清RBP4水平呈正相关进一步通过植入微量渗透泵皮下注射血管紧张素Ⅱ(1 μg/kg/min × 14 d)发现,血管紧张素Ⅱ同样可以增加小鼠血清和白色脂肪组织RBP4的水平。体外实验中,通过培养原代白色脂肪細胞并给予血管紧张素Ⅱ刺激,荧光定量PCR和Western blot证实,血管紧张素Ⅱ可以显著增加白色脂肪细胞内RBP4 mRNA和蛋白的表达给予血管紧张素Ⅱ受体抑制剂一絡沙坦预处理,则可以阻断血管紧张素Ⅱ升高白色脂肪细胞RBP4表达的作用。为了明确RBP4是否具有促心肌细胞肥大作用,通过培养原代乳鼠心肌细胞、并给予不同浓度(25、50、100 μg/ml)的重组RBP4蛋白刺激后,利用免疫荧光检测心肌细胞表面积、计算心肌细胞蛋白/DNA比值、荧光定量PCR检测心肌肥厚相关基因表达的方法评价心肌细胞肥大程度结果发现,RBP4刺激可以呈剂量依赖性诱导心肌细胞肥大,表现为心肌细胞表面积增大、蛋白合成增加以及肥厚相关基因心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,Anp)、脑钠尿肽(Brain species,ROS)的生成增加。给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理,则可以在抑制心肌细胞内氧化应激损伤的同时,减轻RBP4刺激所诱导的心肌细胞炎症因子Tnf-α、Il-6、Mcp-1、Il-1βmRNA的表达升高和心肌细胞的病理性肥大进一步的分子机制研究发现,RBP4刺激可以增加心肌细胞中Toll样受体 4(Toll-like receptor TAK242戓基因敲除Tlr4和Myd88的方法阻断TLR4/MyD88信号通路,则可以明显抑制RBP4刺激所诱导的心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β表达和分泌的增加、ROS的生成增多、以及心肌細胞的病理性肥大。为了明确RBP4在心肌细胞胰岛素抵抗中的作用,通过检测血糖和血清胰岛素水平计算胰岛素敏感指标 HOMA-IR(homeostatic model of insulin resistance)发现,病理性心肌肥厚小鼠血糖及HOMA-IR均有明显升高,并且血清RBP4水平与HOMA-IR呈正相关而在心肌细胞中,RBP4刺激可以明显降低葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter-4,GLUT4)mRNA和蛋白水平。利用荧光标记的2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为底物,通过检测其荧光发现,RBP4刺激可以导致胰岛素刺激诱导的心肌细胞葡萄糖摄取能力的下降通过基因敲除的方法抑制TLR4则可以减轻RBP4刺激所导致的心肌细胞GLUT4表达降低和葡萄糖摄取能力下降。结论:本研究结果显示,脂肪因子RBP4具有促进心肌细胞病理性肥大和胰岛素抵抗的双重莋用,这种作用主要是通过激活TLR4/MyD88依赖的炎症信号通路所介导脂肪因子RBP4作为一个新的促炎症因子,可能是“胰岛素抵抗一病理性心肌肥厚”恶性循环中的关键调控因子。希望通过本研究,能够为未来临床上以RBP4作为药物治疗靶点,预防和改善心力衰竭患者的预后,提供一定的理论依据

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位授予年份】：2016