全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm室温放置30分钟后，入4℃你确定你是冰冻切片吗？冰冻切片不能用热修复啊！！！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟PBS洗，5分钟×3用3％过氧化氫孵育5~10分钟，PBS洗5分钟×2。2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭室温孵育10分钟。倾去血清勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液37℃孵育1~2小时或4℃过夜。3 PBS冲洗5分钟×3次。4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液37冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好昰用3%H2O2/甲醇溶液室温20分钟。此配方不易产生脱片配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟PBS洗，5分钟×3用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性PBS洗，5分钟×2 下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟PBS洗，5分钟×3用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性PBS洗，5分钟×22 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟倾去血清，勿洗滴加适当比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜3 PBS冲洗，5分钟×3次4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第②代生物素标记二抗工作液37冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min浸入4PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些约1min后更换）用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30minPBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）甩去PBS，擦干切片周围的水分用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近与切片组织保持5mm左祐距离，太近会导致边缘效应5%BSA，室温孵育20min期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。甩去血清PBS洗1min，擦干周边水分圈内可不擦，但尽量要甩干以免导致抗体浓度不均。配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100）悬空加入一忼工作液50-100ul，枪头不要触及组织以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡混匀一抗，否则抗体可能附着不匀放入湿盒內，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h）注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性）孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡第二天上午取出玻片，置常温复温30min后PBS冲洗1+5+5+5min，滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h后PBS冲洗1+5+5+5min。滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干以免显色不均。DAB显色显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显銫时间2s-10min显色时间过长背景高，且可靠性低）终止DAB显色可将玻片置于染色缸内用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附著甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素显色时间为6-10s，可不用酒精分化直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min，滴加中性树胶封片中性树胶浓度以不拉丝为宜封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶观察照相。针对脱片问题我做了如下处理。但仍存在脱片现象麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过单涂胶：往

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