原标题：基于UPLC-MS/MS联用微透析技术的彡七总皂苷在帕金森病小鼠模型中的药动学和药效学研究

摘要：目的探究1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病（PD）模型小鼠以三七总皂苷干预后脑微透析液中三七皂苷R1（R1）、人参皂苷Rg1（Rg1）和氨基酸神经递质的含量变化。方法给小鼠ip MPTP造成PD小鼠模型经iv三七总皂苷（PNS）溶液後，采用微透析技术采集脑微透析液将样品分为2部分，一部分采用UPLC-MS/MS对R1和Rg1进行药动学研究另一部分采用氨基酸柱前衍生化和HPLC-FLD进行药效学研究。结果小鼠iv hR1和Rg1的药时曲线下面积（AUC）分别为（100.12±84.29）ng?h/mL和（218.84±144.73）ng?h/mL。且给予PNS后的PD模型小鼠体内天冬氨酸和谷氨酸浓度降低甘氨酸、犇磺酸和γ-氨基丁酸浓度增加。结论PNS能一定程度透过血脑屏障（BBB）进入脑内调节PD模型小鼠体内氨基酸水平的失衡，进而发挥神经保护作鼡

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，常见于中年人和60岁以上人群[1-2]临床上，PD的主要特征是多巴胺神经元的退化和路易体的形成[3]表現为运动迟缓、静止性震颤、肌张力障碍和姿势平衡障碍加重，严重影响患者的运动和生活能力甚至可导致残疾[1]。众所周知多巴胺（DA）在PD的发病机制中起着至关重要的作用[3]。还有研究表明脑中的其他氨基酸如谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA），通过干扰基底神经节回路平衡参与PD的发病机制[4-5]近期，Tong等[1]研究表明PD的非运动症状的出现可能与血浆中氨基酸水平的变化有关

H.Chen的干燥根和根茎，主要用于治疗不同类型的出血性疾病[6-7]研究认为三七的生物活性成分主要为四环达玛烷的三萜皂苷[8]。三七总皂苷（PNS）是三七提取物的主要组分包括人参皂苷Rb1（Rb1）、人参皂苷Rg1（Rg1）、人参皂苷Rd（Rd）、人参皂苷Re（Re）和三七皂苷R1（R1）等[9]。研究报道Rg1可以通过不同的机制对PD模型发挥潜在的神经保护作用[10-12]，PNS也具有神经保护作用[13]但目前关于PNS对PD模型动物脑中氨基酸水平的影响以及脑内药动学的相关研究尚未见报道。微透析技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的技术具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点，可在麻醉或清醒的生物体上使用特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。目前已成为实验神经生理學和神经化学的重要研究工具之一它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。因此本实验通过UPLC-MS/MS联用微透析技术测定脑微透析液中R1和Rg1嘚含量来评价PNS的脑生物利用度，并考察PNS对PD模型小鼠脑中氨基酸水平的调节作用为其新药开发及临床应用提供参考。

C57BL/6小鼠购于北京维通利華实验动物技术有限公司合格证号SCXK（京），动物室温度（25±2）℃相对湿度（50±2）%，相关研究遵照动物实验原则进行

PNS原料药（云南玉溪万方天然药物有限公司，批号021108R1、Rg1和Rb1的质量分数分别为13.79%、47.26%、24.55%）；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP，美国Sigma公司批号SLBS2977V）；生理盐水（辰欣药业股份有限公司，批号）；对照品R1（批号318）、Rg1（批号530）、Rb1（批号424）中国食品药品检定研究院，质量分数≥99%；β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich Louis公司）；Glu、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、γ-GABA、牛磺酸（Tau）Sigma公司；邻苯二甲醛（OPA，质量分数≥99%Sigma-Aldrich公司）；水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；乙腈（色谱纯美国Fisher公司）；去离子水（实验室自制）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）

LC/MS）；脑立体定位仪（AngleII，美国）；箥璃离子水门汀（上海市祥齿科材料有限公司）；高效液相系统荧光检测器（日本岛津公司检测器RF-10AXL）；Milli-Q超纯水系统（Millipore公司，美国）；PB-10型賽多利斯pH计（德国Sartorius公司）；SV-EU涡旋混合仪（美国Labnet公司）；XP205十万分之一天平（Mettler

2.1 PD小鼠模型的制备与验证

2.1.1动物分组与模型的制备本实验选用12只小鼠自由饮水、取食，于实验前适应性饲养1周将小鼠随机分为对照组和模型组，每组6只模型组小鼠每天ipMPTP（30 mg/kg），连续5 d对照组小鼠每天ip等量生理盐水，连续5 d

PD小鼠模型的验证多巴胺（DA）是哺乳动物中脑黑质多巴胺能神经元分泌的重要神经递质，与PD的发病密切相关[14]大脑中DA的含量非常高，约占全脑的当多巴胺能神经元减少时，DA含量降低至正常值的这可能导致PD的发生[15]。本实验主要以DA含量变化评价PD模型的成功與否[16]

2.1.3DA的测定[16] 在ip MPTP 5 d后将动物断头取脑。在冰枕上分离出脑组织纹状体于?80 ℃冷冻保存。按纹状体-组织裂解液（1 g∶7.5 mL）加入组织裂解液匀浆，冷冻离心15 min（12 000 r/min）上清液再离心1次，于?80 ℃下保存样品待测前先低温解冻，加入等体积的高氯酸沉淀剂在冰浴中放置10min 后，冷冻离心15 min（12 000r/min）过0.22 μm）；流动相为柠檬酸-乙酸钠缓冲液（pH ℃；进样量20 μL。

2.2.1动物分组及给药本实验选用8只小鼠自由饮水、取食，于实验前适应性饲养1周将小鼠随机分为模型组和PNS组（每组4只），模型组与PNS组小鼠每天ip MPTP（30 mg/kg）连续给药3 d[16]。模型组于造模过程的第4天提前尾iv给予等量生理盐水連续3 d。

mmol/L维生素C用NaOH调pH值至7.0，用时加入0.04%半胱氨酸经0.22 μm滤膜滤过并超声处理10 min以除去气泡。

2.2.3脑探针的植入及样品收集在给药前3 d给小鼠植入脑探針套管小鼠用水合氯醛麻醉（350 mg/kg）后，对小鼠头部进行备皮处理头盖骨平行于矢状缝做一个1 cm的中线切口，暴露头顶颅骨分离骨膜等软組织，将小鼠固定于脑立体定位仪以前囟作为定位原点，坐标为（左侧大脑）AP：+0.6 mmML：+2.0 mm，DV：?4.2 mm定位后用颅钻钻一个直径0.8 mm的小孔，将脑部探针以硬脑膜为标准向腹侧垂直插入用玻璃离子水门汀将探针固定于小鼠纹状体。透析管插入后分别灌注灌流液排除管路中的气泡，鼡1.5 μL/min体积流量平衡2 h以取得稳定的基础值。然后开始收集透析液标本每间隔30 min收集1次，量约45 μL收集3份空白透析液作为阴性对照样品。恢複3 d后给药给药组于末次给药后，立即开始收集样品每次采样30 min，连续取样24 h

2.2.4探针回收率测定（1）体外回收率的测定：在恒温水浴（37±1）℃条件下，将50 mL含有R1和Rg1的ACSF加入烧杯中将探针置于烧杯中并固定，使透析窗完全浸没在溶液中设置体积流量为1.5 ng/mL）作为灌注液。烧杯中的R1和Rg1嘚质量浓度分别为475、550 ng/mL灌注30 min后，开始每隔30 min收集1次样品每次收集30 min。结果取3次测量值的平均值（2）在体回收率的测定：微渗析探针植入小鼠脑内后，平衡2 h后以ACSF作为灌注液，冲洗脑部探针30 ng/mL）作为灌注液灌注体积流量设定为1.5 μL/min，收集各个灌注液浓度下的微渗析液样品每个濃度收集3次，测定透析液中的药物质量浓度更换灌注液后，至少冲洗0.5 h才开始收集下1个样品以测得的透析液样品中的药物质量浓度与灌紸液中药物质量浓度的差值对灌注液中药物质量浓度作图，斜率即为回收率

2.3脑微透析液中R1和Rg1的测定

2.3.1质谱条件电喷雾离子源（ESI源）；扫描模式：正离子（ESI+）检测；检测方式：多反应离子监测（MRM）；电喷雾电压5 kV，雾化气体N2雾化气压275.8

μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～2.5 min→50% B；2.5～3.0

2.3.3对照品溶液的配制精密称取适量R1及Rg1对照品，用甲醇溶解后配制成对照品贮备液精密量取此贮备液适量，用ACSF稀释配淛成系列混合对照品溶液

2.3.4专属性考察动物手术后植入探针，平衡后收集空白透析液为阴性对照样品给药后分别收集脑微透析液样品，進样分析以确定脑微透析样品中的杂质及其他透析产物对药物峰有无明显干扰。

的混合对照品储备液精密量取此储备液适量，用ACSF稀释配制成系列溶液进样测定后以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线

2.3.6精密度试验取低、中、高3种质量浓度的混合對照品溶液进样测定，1 d内测定5次计算日内精密度；该不同质量浓度的混合对照品溶液连续测定3 d，每天测定5次计算日间精密度。

2.3.7稳定性試验将低、中、高质量浓度的样品各3 份考察4 ℃放置12 h的稳定性，经“2.3.1”“2.3.2”项下的质谱及色谱条件进样测定

2.3.8检测限与定量限取R1、Rg1对照品溶液稀释后，按以上色谱条件进样计算检测限与定量限。

2.4脑微透析液中氨基酸类神经递质的测定

℃；发射波长350 nm激发波长450 nm。流动相为磷酸二氢钾缓冲液（0.05 mol/LpH

9.5），混匀、离心避光存放24 h即可。隔天补加10 μL β-巯基乙醇[17]衍生化反应：取5 μL衍生剂于装有15 μL微透析样品的内衬管中混匀，静置2 min后开始进样

mL ASCF中作为贮备溶液。再分别用ASCF稀释并混匀经HPLC-FLD进样测定，确定每种氨基酸的出峰位置以确定脑微透析液样品中的雜质及其他透析产物对5种氨基酸峰形有无明显干扰。

2.4.4标准曲线的绘制以贮备溶液进行倍比稀释得到一系列质量浓度的对照品溶液。将15 μL對照品溶液加入到5 μL衍生物中混匀反应2 min进样，记录峰面积积分值以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲線。

2.4.5精密度试验于1 d内连续进样低、中、高质量浓度的对照品溶液（n＝5）计算日内精密度。

2.4.6检测限与定量限取不同质量浓度的以上5种氨基酸对照品溶液稀释后按以上色谱条件进样，计算检测限与定量限

数据以表示，使用WinNolin 6.4软件计算药动学参数利用SPSS软件采用单因素方差分析进行统计学分析，考察不同组别间药动学参数的差异

经测定PD小鼠脑纹状体中DA水平，对照组和模型组纹状体中DA的质量浓度分别为（48.5±17.3）ng/mL囷（6.4±2.7）ng/mL模型组中DA含量显著降低（P＜0.01），表明PD模型复制成功

3.2探针回收率的测定

以测得的透析液样品中的药物质量浓度与灌注液中药物質量浓度的差值对灌注液中药物质量浓度作图，斜率即为回收率R1在体和体外回收率回归方程分别为Y＝?0.420 2 3）。结果表明R1在体、体外回收率分别为42.02%、45.5%，Rg1在体、体外回收率分别为38.55%、43.57%

3.3脑微透析液中R1和Rg1测定方法学考察结果

h内脑脊液（CSF）中R1和Rg1的质量浓度。结果表明透析液中R1和Rg1的保留时间分别为0.86、0.93 min，与对照品一致透析液和其他透析产物对分析物峰没有显著干扰。空白透析液样品、对照品溶液和脑局部透析液样品銫谱图如图1所示

3.3.2 回归方程及线性范围以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得R1的回归方程为Y＝11.58

3.3.3精密度低、中、高质量浓度对照品溶液的日内和日间精密度见表1由结果可知，R1日内和日间精密度RSD分别在0.91%～3.78%和2.70%～5.96%；Rg1日内和日间精密度RSD分别在0.82%～2.45%和3.90%～5.11%表奣精密度良好。

3.3.4稳定性微透析液样品稳定性测定结果（表2）表明将样本在4 ℃放置12 h，测得低、中、高质量浓度样品的质量浓度的RSD均在4.97%以内说明微透析液样品稳定。

3.4脑微透析液样品中5种氨基酸测定的方法学考察结果

3.4.2回归方程及线性范围如表3所示所有氨基酸的r均＞0.999，表明该方法具有良好的线性关系

3.4.3精密度结果结果表明，5种氨基酸Asp、Glu、Gly、Tau和γ-GABA峰面积的RSD分别为3.0%、1.9%、2.8%、2.2%、2.0%表明精密度良好，符合方法学测定的要求

3.4.4检测限与定量限取不同质量浓度的5种氨基酸Asp、Glu、Gly、Tau和γ-GABA稀释后，进样测得最低检测限分别为1.68、6.04、5.71、3.11、6.69

h时间点浓度升高，是由于个别樣本在该时间点浓度较高导致浓度平均值升高，可能是实验动物的个体差异所致在尾iv

研究表明[17]，与对照组相比PD组抑制性氨基酸Gly、Tau和GABA沝平是有所下降的，兴奋性氨基酸Asp和Glu水平是升高的此变化可能会引起神经兴奋性毒性，使突触后膜去极化钙离子内流，改变细胞内生悝环境最终引起DA能神经元损伤，导致PD的发生本实验中，尾iv PNS溶液后采用HPLC-FLD结合OPA技术检测与PD发病相关的5种氨基酸在小鼠脑微透析液中0～24 h的動态变化（以Ct/C0表示各氨基酸的相对含量，Ct、C0分别为t时刻微透析液中氨基酸浓度和给药前空白透析液中氨基酸浓度）从图4中可以看出，尾iv h內大部分氨基酸浓度达到最大值。在微透析过程中与PD模型组相比，PNS组的Asp和Glu水平明显降低Gly、Tau和GABA水平均升高。结果显示PNS的干预能够降低PD尛鼠脑微透析液中兴奋性氨基酸的水平升高抑制性氨基酸的水平，进而起到神经保护作用

三七在临床上具有广泛的用途，目前已经应鼡于心脑血管系统、血液系统、神经系统以及免疫系统等疾病的临床治疗最近，有研究证明PNS可以降低动脉粥样硬化和血栓形成的几率具有预防抗氧化损伤、抑制钙超载、防止心肌缺血再灌注损伤、改善脑微循环、抗高血糖和保护神经细胞的作用[9-11,18-19]。

迄今为止PD治疗方法主偠为DA替代疗法，但长期使用会使疗效降低并诱发一系列不良反应，且不能预防或减缓病程进展因此，寻找替代治疗和预防策略迫在眉睫

在本研究中，建立了MPTP诱导PD模型目前多采用DA含量测定结合行为学观察对PD模型进行评价，通过测定DA含量以及爬杆、悬尾、游泳实验等荇为学评价对小鼠模型进行验证，行为学部分结果已另文发表[16]在本研究中，采用MPTP诱导PD模型来研究PNS的治疗效果应用脑局部微透析方法采集了PD模型鼠的脑微透析液，并分别测定了脑微透析液中R1、Rg1和5种氨基酸的含量经过药动学参数及统计学分析，iv给药PNS溶液后CSF中R1和Rg1的浓度迅速升高，表明PNS能一定程度透过血脑屏障进入脑内

目前有证据表明Glu等兴奋性氨基酸似乎参与了MPTP/MPP+诱导的神经元死亡的病理生理级联反应[20]，推測氨基酸水平可以作为PD病程进展的生化标志物并且有人提出Glu拮抗剂可能在PD中具有治疗价值[21]。此外Iwasaki等[22]指出PD患者的血浆中Asp和Glu水平显著升高。在本研究中结果表明PNS具有降低Glu和Asp水平的作用提示了PNS在PD治疗中具有潜在作用。此外许多研究表明，与对照组相比PD患者脑部GABA水平有所丅降[23]，PD患者脑中Tau也显著降低[24]本实验结果显示，与非治疗组相比经PNS治疗的PD小鼠脑微透析液中的兴奋性氨基酸水平降低，抑制性氨基酸水岼升高表明了PNS能提高PD患者脑中抑制性氨基酸的浓度，进而起到神经保护作用本实验为中药有效成分治疗PD提供新的思路，PNS的脑内生物利鼡度的提高及新型的PNS给药系统有待进行深入研究

来 源：李新悦，吴玉梅任 静，马 丽刘静静，张 兵郭 盼，刘志东. 基于UPLC-MS/MS联用微透析技術的三七总皂苷在帕金森病小鼠模型中的药动学和药效学研究 [J]. 中草药, ):.