肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对莫能菌素产量的影响--《华中农业大学》2007年硕士论文
肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对莫能菌素产量的影响
【摘要】：
接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用，此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解，在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率，目前，肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)的体内遗传操作主要通过原生质体来完成，本研究率先探索了大肠杆菌-肉桂地链霉菌接合转移系统，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，转化ET12567(pUZ8002)，然后接合转移肉桂地链霉菌BIB2005，优化接合转移条件。获得了较好的转化效果。
nsdA基因(negative regulator of streptomyces differentiation)是一个在链霉菌基因组中广泛存在的全局性负调控因子，基因序列保守。迄今为止，nsdA基因改造在工业菌株中的应用还没有相关的报道，本研究率先在肉桂地链霉菌的工业菌株中开展了nsdA的基因中断工作。
本研究利用生物信息学分析基因组已知的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌nsdA及相邻序列，设计通用引物P1，P2，在肉桂地链霉菌BIB2005总DNA中扩增nsdA同源基因及其两侧序列的4.8kb的片段并测序验证。合成一对长度分别为58，59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与nsdA基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒(aac(3)Ⅳ+oriT)两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化表达λRed重组酶且含有目标质粒的Escherichia．coli菌株BW25113／pIJ790／pBIB118，获得了阳性重组质粒pBIB929，再接合转移至肉桂地链霉菌BIB2005，筛选得到表型为Apr~RKan~S的接合子BIB309。PCR验证nsdA基因已被正确中断。与出发工业菌株相比，中断株在形态上较出发菌株发生了较大的变化，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：Q78【目录】：
ABSTRACT8-10
缩略语10-11
第一章 前言11-22
1.聚醚类抗生素11-12
1.1 简介11
1.2 聚醚类抗生素的作用机理和化学合成11-12
1.3 聚醚类抗生素的产生菌12
2.莫能菌素12-19
2.1 莫能菌素的化学结构及性质12-13
2.2 莫能菌素的生物合成13-14
2.3 莫能菌素分子生物学研究进展14-19
2.3.1 概述14-15
2.3.2 莫能菌素的前体合成15-18
2.3.3 ccr(丁烯酰辅酶A还原酶基因)18
2.3.4 meaA(甲基丙二酰CoA基因),icm(异丁酰辅酶A的异构酶基因)18
2.3.5 monBⅠ,monBⅡ(异构酶基因)18
2.3.6 monH,monRⅠ,monRⅡ(转录调节基因)18-19
3.抗生素合成的调控19-22
3.1 途径专一性调控19
3.2 抗生素合成的全局调控19
3.3 双组份调控19
3.4 nsdA基因简介19-20
3.5 本课题立题依据及意义20-22
第二章 材料与方法22-32
2.1 材料22-26
2.1.1 菌株22-23
2.1.2 质粒23
2.1.3 PCR引物23-24
2.1.4 培养基和生化试剂24-26
2.1.5 仪器设备26
2.2 实验方法26-32
2.2.1 菌种培养及保藏26-27
2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取(碱裂解法)27
2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及质粒的热激转化27
2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测27
2.2.5 链霉菌总DNA的少量快速提取27-28
2.2.6 PCR28
2.2.7 DNA片段的回收28-29
2.2.8 载体的去磷酸化29
2.2.9 DNA连接29
2.2.10 PCR介导的定向基因置换技术29-30
2.2.11 大肠杆菌与链霉菌之间的属间孢子接合转移30-31
2.2.12 发酵培养31
2.2.13 菌体浓度的测定31
2.2.14 莫能菌素效价的测定31-32
第三章 结果与分析32-49
3.1 大肠杆菌-肉桂地链霉菌BIB2005接合转移系统的建立和优化32-33
3.1.1 大肠杆菌—肉桂地链霉菌BIB2005属间接合转移,本研究尝试了以下方法32-33
3.2 基因中断和基因置换的基本原理33-34
3.3 PCR介导的基因中断和基因置换的基本原理34-37
3.4 nsdA基因中断载体的构建37-41
3.4.1 肉桂地链霉菌负调控基因nsdA的检测。37
3.4.2 PCR克隆nsdA及两侧基因37-39
3.4.3 肉桂地链霉菌nsdA基因序列分析39-40
3.4.4 PCR扩增两侧与nsdA基因同源的抗性标记40-41
3.5 nsdA基因置换载体的构建41-44
3.5.1 将PCR回收产物装载在AT载体,构建pBIB90641-42
3.5.2 重新构建置换载体42
3.5.3 筛选转化子42-43
3.5.4 重组质粒的PCR验证43-44
3.5.5 pBIB929通过接合转移导入肉桂地链霉菌。44
3.6 筛选双交换菌株44-45
3.6.1 筛选44-45
3.7 nsdA基因中断的PCR验证45-46
3.8 nsdA基因中断菌株的生物表型46-47
3.9 nsdA中断株发酵分析47-49
第四章 总结与讨论49-52
4.1 总结49
4.1.1 构建并优化了大肠杆菌-肉桂地链霉菌接合转移系统49
4.1.2 首次克隆了肉桂地链霉菌nsdA基因,并完成nsdA全基因组测序。49
4.1.3 肉桂地链霉菌nsdA基因的中断。49
4.2 讨论49-51
4.2.1 关于接合转移体系的构建49-50
4.2.2 关于基因中断载体的构建50
4.2.3 关于电转化50-51
4.2.4 关于nsdA基因的中断51
4.3 展望51-52
参考文献52-56
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【参考文献】
中国期刊全文数据库
熊伟,梁运祥,朱浩君,闵勇,吕和平,郑应华;[J];农业生物技术学报;2005年05期
朱浩君,梁运祥,周俊初,郑应华;[J];微生物学报;2004年02期
周钰;[J];抗生素;1980年05期
周亦昌,龚炳永;[J];抗生素;1984年03期
刘树勋;[J];抗生素;1984年03期
朱浩君,郑应华;[J];中国抗生素杂志;2003年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
冀彦锡;吴焱鑫;李杰;;[J];安徽农业科学;2011年18期
梁剑光;黄鹏;徐正军;;[J];常熟理工学院学报;2007年04期
刘碧容;温海祥;;[J];佛山科学技术学院学报(自然科学版);2006年01期
石贤爱;李聪颖;陈飞;邱小明;孟春;郭养浩;;[J];福州大学学报(自然科学版);2010年01期
刘丰喜;田耀;;[J];发酵科技通讯;2012年04期
卢明莹;;[J];中国科教创新导刊;2013年25期
薛红燕;马焕普;薛金华;刘志民;;[J];果树学报;2013年05期
刘铁军;李炯;;[J];河北工业科技;2011年04期
刘柯柯;张力;韩向敏;张君胜;杨小志;;[J];湖北农业科学;2011年13期
赵梦清;白新荣;赵素霞;于桂花;鲍建芝;;[J];河北化工;2008年05期
中国博士学位论文全文数据库
曾化伟;[D];江南大学;2011年
曹冬梅;[D];吉林农业大学;2011年
解春艳;[D];南京农业大学;2010年
杨强大;[D];东北大学;2009年
刘力强;[D];河北农业大学;2006年
杨丽萍;[D];华中农业大学;2007年
闵勇;[D];华中农业大学;2006年
夏海洋;[D];华中农业大学;2006年
沙玉圣;[D];南京农业大学;2007年
赵喜红;[D];华南理工大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
陈若雯;[D];华中农业大学;2010年
李政;[D];武汉工业学院;2010年
陈妍;[D];河北农业大学;2011年
牟琳;[D];江南大学;2011年
王海晶;[D];吉林农业大学;2011年
陈君娜;[D];山东轻工业学院;2011年
邹娟;[D];华东理工大学;2011年
王福岭;[D];天津大学;2011年
秦艳飞;[D];安徽工程大学;2011年
仲松;[D];安徽工程大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
朱浩君,梁运祥,周俊初,郑应华;[J];微生物学报;2004年02期
梁漱芳,武济民,陈德民,王镜新,蔡润生;[J];抗生素;1984年03期
朱浩君,郑应华;[J];中国抗生素杂志;2003年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
肖杰;[J];遗传学报;2000年12期
许铭翾;朱颖旻;沈美娟;姜卫红;赵国屏;覃重军;;[J];生物化学与生物物理进展;2006年10期
钱海伦;;[J];中国药科大学学报;1984年03期
管征，颜望明;[J];微生物学通报;1994年02期
苏鸿声;相望年;戴秀玉;陆德如;;[J];微生物学报;1989年03期
张学贤,周俊初,张忠明,李阜棣,陈华癸;[J];华中农业大学学报;1992年02期
赵巍，张成刚，蔺继尚;[J];微生物学杂志;1994年02期
王小东;康丽华;毛慧玲;江业根;马海滨;张希涛;;[J];安徽农业科学;2007年03期
陈芬;熊伟;闵勇;范与庆;梁运祥;吕和平;邢仁昌;郑应华;;[J];农业生物技术学报;2007年06期
高峰;王斌;陈太春;汪志军;安德荣;;[J];微生物学报;2010年03期
中国重要会议论文全文数据库
张杰;彭于发;赵建周;陈彩层;黄大昉;;[A];“植物病虫害生物学研究进展”——植物病虫害生物学国家重点实验室研究论文选[C];1995年
郎莉莉;白骅;吴振倡;;[A];第八届全国激光生物学学术会议暨《激光生物学》创刊十周年庆祝会会议指南及论文摘要[C];2002年
方晔;李向阳;杨锦红;李方去;韩珍;;[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年
方晔;李向阳;杨锦红;李方去;韩珍;;[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年
李向阳;方晔;杨锦红;;[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
袁永明;郑大胜;周帼萍;窦建琳;黎佳;袁志明;;[A];中国微生物学会《第二届全国农业微生物研究及产业化研讨会》和《第十一届全国杀虫微生物学术研讨会》暨《湖北省暨武汉市微生物学会和内蒙古微生物学会2008年会》论文摘要[C];2008年
胡晓敏;Bjarne Munk HNiels Bohse HJфrgen ELasse SGert Bolander J袁志明;;[A];湖北省生物工程学会2004年年会学术报告及论文摘要汇编[C];2004年
赵清;刘相梅;詹杨;边疆;刘缨;林建群;颜望明;;[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
韩珍;李向阳;杨锦红;李方去;方晔;;[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年
沈凤英;何丽明;刘大群;李亚宁;;[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库
张鹏翼;[D];山东大学;2010年
喻云梅;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
侯艳华;[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2006年
夏志洁;[D];山东大学;2007年
达来宝力格;[D];华中农业大学;2008年
魏杰;[D];沈阳农业大学;2009年
胡晓敏;[D];中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）;2007年
文勇;[D];复旦大学;2005年
许铭翾;[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年
林荔雯;[D];华中农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库
陈芬;[D];华中农业大学;2007年
沈凤英;[D];河北农业大学;2009年
钱迪;[D];安徽大学;2013年
刘隽;[D];华中农业大学;2001年
范与庆;[D];华中农业大学;2007年
何群香;[D];华中农业大学;2008年
郭锁莲;[D];东北农业大学;2009年
熊伟;[D];华中农业大学;2005年
余姣姣;[D];华中农业大学;2010年
耿旭梅;[D];中南民族大学;2013年
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无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响62
微生物学报ActaMicrobiologicaS；无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的；11，2*；余姣姣，陶美凤；（1华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉4；200030）；（2上海交通大学生命科技学院微生物代谢实验室，上；摘要：【目的】阿维链霉菌可作为异源表达抗生素生物；试验筛选出最佳的CaCl2和MgCl2浓度组合，；文献标识码：A；
微生物学报ActaMicrobiologicaSinica50（11）：；4November2010ISSN；CN11－1995/Qhttp：//journals./actamicrocn无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响11，2*余姣姣，陶美凤（1华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉430070）200030）（2上海交通大学生命科技学院微生物代谢实验室，上海摘要：【目的】阿维链霉菌可作为异源表达抗生素生物合成基因簇的良好宿主，但是需要优化含有大片段DNA质粒的接合转移效率。【方法】NaCl、Ca（NO3）2和CaCl2等4种无机盐，我们选取MgCl2、在0－200mmol/L浓度范围内分别研究其对大质粒向阿维链霉菌接合转移的影响，再设计完全随机试验筛选最佳CaCl2对阿维链霉菌接合转移有极明显的促进作用，MgCl2也有一定提高作用。通过完全随机条件。【结果】试验筛选出最佳的CaCl2和MgCl2浓度组合，使大质粒的接合转移效率提高11倍。同时，本研究还发现阿维链霉菌异源表达放线紫红素的最适培养基，成功表达放线紫红素。【结论】特定无机盐对阿维链霉菌接合转移效率有明显提高作用，并且能促进放线紫红素在阿维链霉菌中的表达。关键词：阿维链霉菌；接合转移；异源表达；放线紫红素中图分类号：Q933文献标识码：A）11-1556-06文章编号：0001-系统［3］链霉菌能产生多种多样的次级代谢产物，如抗生素、抗癌药物等而受到广泛关注。对特定次级代谢途径进行深入研究是开展抗生素菌种理性选育的基础，在抗生素产生菌中开展这些研究需要建立实用的遗传操作体系［1］。综上所述，采用阿维链霉菌作为异源宿主表达聚酮类抗生素基因簇有明显优点。但是我们用含放线紫红素基因簇的大质粒进行尝试时发现，在大质粒向阿维链霉菌接合转移效率常用的条件下，很低，不利于异源表达研究。因此，本研究试图优化阿维链霉菌的接合转移体系，提高大质粒的接合转移效率，在此基础上尝试异源表达聚酮类抗生素放线紫红素基因簇。。由于链霉菌限制修饰系统很多抗生素产生菌仍然很难进行及其它未知原因，有效的遗传操作，需要系统地探索、优化现有的技术体系。将基因簇转到容易操作的异源宿主中表达，在异源宿主中研究次级代谢及其调控是一个很好的替代选择［2］。11.1材料和方法材料菌株：阿维链霉菌NRRL8165、大肠杆菌阿维链霉菌产生重要的杀虫抗生素阿维菌素，经过长期工业化生产实践，其发酵工艺已很成熟；阿维链霉菌的全基因组已经完成测序，有详细的基因有利于后续的次级代谢基因簇表达调控研组注释，究［3］1.1.1DH5α和ET12567/pUZ8002均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室链霉菌室保存。1.1.2质粒：pMM1是含有放线紫红素生物合成基因簇的pSET152衍生质粒，约45kb，含阿泊拉霉素大肠杆菌复制子、链霉菌噬菌抗性基因aac（3）IV、；阿维链霉菌产生聚酮类抗生素阿维菌素，体内必然能产生丰富的聚酮类抗生素合成所需前体和辅因子；阿维链霉菌已经建立了较完善的遗传操作基金项目：自然科学基金（）*21-1；Fax：+86-21-；E-mail：tao_meifeng@通信作者。Tel：+86-作者简介：余姣姣（1985－），女，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为链霉菌分子生物学。收稿日期：；修回日期：余姣姣等：无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响./微生物学报（）1557体ΦC31的整合功能区、接合转移起始区（oriT）和完整的放线紫红素基因簇（王业民，陶美凤，未发表）。pUZ8002为RP4衍生质粒，与含oriT的质粒共存于同一个大肠杆菌细胞时可促进后者向合适受常用作大肠杆菌-链霉菌属间接合转体菌接合转移，移的辅助质粒1.1.3［1］液均匀涂布于含有不同种类无机盐的2CM或F3培养基的平板（=9cm），于30℃培养16－20h，用含有TMP和阿泊拉霉素的1mL水溶液均匀覆盖平板至两种抗生素终浓度分别为50mg/L。接合表面，转移阴性对照只涂布同样数量链霉菌孢子，其它处理完全相同。将平板继续置于30℃培养2－10d，观察接合转移子，并计数。1.4供体菌和阿维链霉菌NRRL8165孢子计数利用稀释涂平板法计数得到菌体的菌落形成单位（cfu），具体方法见文献1.5接合转移频率计算根据链霉菌遗传操作手册，接合转移频率=接合转移子数目/受体菌落形成单位（cfu）1.6接合转移子验证挑选接合转移子到含阿泊拉霉素和TMP的F3培养基上培养，初步验证它们对阿泊拉霉素具有抗将菌丝体转接到含有阿泊拉霉素性。生长5d后，和TMP的液体培养基YEME中培养36－48h，收抽提总DNA作为模板，扩增pMM1携带集菌丝体，的actⅡ-orf4（0.8kb）片段。以野生型菌株的总DNA为阴性对照。actⅡ-orf4扩增引物为pHindⅢ：CAAGCTTCTACACGAGCACCTTCTC和pNcoI：CCCATGGGATTCAACTTATTGGGACGT。PCR反应5min；95℃，30s；55℃，50s；72℃，条件为：95℃，1min；30个循环；72℃，10min。［1］［10］。［4］培养基：大肠杆菌培养用LB培养基；阿［5］维链霉菌NRRL8165产孢用YMS培养基；大肠杆菌与阿维链霉菌接合转移培养基采用F3和2CM。F3（每升）［6］：可溶性淀粉20g，KNO31.5g，NaCl0.5g，MgSO4?7H2O0.5g，MnSO4?7H2O8.45mg，自然pH。用F3测定无机盐对接合转移影响时不加七水硫酸镁。2CM（每升）［7］。：可溶性淀粉10g，胰蛋。NaCl1g，（NH4）2SO42g，K2HPO41g，白胨2g，CaCO32g，无机盐溶液1mL，琼脂20g，蒸镏水1000mL，pH7.2。其中无机盐溶液为（每升）：FeSO4?7H2O1g，MgCl?6H2O1g，ZnSO4?7H2O1g。ISP2、ISP4、R2YE［1］和阿维菌素发酵培养基1和2［8］均用于尝试放线紫红素的异源表达。YEME激处理。1.1.4抗生素与生化试剂：在大肠杆菌中抗生素使25mg/L氯霉素、用浓度为：50mg/L卡那霉素、50mg/L阿泊拉霉素（apramycin）；链霉菌接合转移子筛选用50mg/L阿泊拉霉素；接合转移平板另外TMP）覆盖50mg/L三甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，用于抑制大肠杆菌供体菌。1.21.3等［9］［1］用于［4］液体培养阿维链霉菌；2×YT用于阿维链霉菌热22.1结果和分析F3上添加不同无机盐对大肠杆菌-链霉菌接采用F3为接合转移培养基，分别添加不同浓链霉菌的培养与总DNA的提取［1］链霉菌培养、总DNA提取见参考文献。合转移频率的影响NaCl、Ca（NO3）2和CaCl2，每个浓度3度的MgCl2、个平板，即3个重复。每个接合转移使用的链霉菌7大肠杆菌细胞数目为孢子数目为1.88×10cfu，大肠杆菌-链霉菌属间接合转移大肠杆菌-链霉菌属间接合转移参考Flett，具体方法如下：供体菌为ET12567/pUZ8002/pMM1，受体菌为阿维链霉菌NRRL8165新鲜孢子。将ET12567/pUZ8002/pMM1接种于5mLLB培养37℃培养过夜。然后按1：100将过夜培养物接基，种于含有卡那霉素、氯霉素、阿泊拉霉素的新鲜LB中，于37℃继续培养至OD600=0.4－0.6；用等体积新鲜的LB洗涤菌体2次洗掉抗生素，加适量新鲜LB悬浮大肠杆菌细胞，分装备用。取链霉菌孢50℃水浴热激处理子悬浮在500μL2×YT中，10min。将处理好的大肠杆菌和冷却至室温的阿维12000r/min离心30s，链霉菌孢子悬液混和，弃去用残留的液体重新悬浮细菌沉淀块，将混合菌上清，1.27×107cfu，供受比为0.68。接合转移平板覆盖抗生素后继续培养，第3－5天观察接合转移子。观察结果如下：阴性对照没有长出菌落；不额外添加无只有两个分别生长出3个抗性机盐的12个平板中，菌落；额外添加4种无机盐的平板分别长出数目不同的阿泊拉霉素抗性接合转移子。根据接合转移子数计算得到接合转移频率（表1），从表1中可以看4种盐对接合转移频率都有极显著影响（P&出，0.01）。添加20mmol/LMgCl2显著提高接合转移效率，与文献一致［11］，以此条件作为接合转移的常1558JiaojiaoYuetal./ActaMicrobiologicaSinica（）CaCl2的提高作用规条件对照。与常规条件相比，最显著，添加浓度为120mmol/L时接合转移频率最－6高，提高6.8倍，达到4.48×10接合子/cfu；浓度10－6接合子/cfu，提高4.5倍以上。其次为MgCl2，60、80和120mmol/L时每个平板上都在浓度为40、－6有近30个接合转移子，接合转移频率&1.17×10接合转移频率均&3×在80－180mmol/L之间时，表1Table1Concentrationofsalt/（mmol/L）200*接合子/cfu，是常规条件的近2倍。F3上不同无机盐对大肠杆菌-链霉菌接合转移频率的影响－6EffectsofdifferentsaltintheF3mediumontheE.coli-StreptomycesconjugationefficiencyE.coli-StreptomycesconjugationfrequencyonF3mediumsupplementedwithdifferentSalt/（×10MgCl20.07（0.07）0.66（0.12）1.12（0.22）1.11（0.06）1.04（0.18）0.60（0.12）0.77（0.14）1.17（0.10）0.30（0.16）0.78（0.07）0.26（0.06）NaCl0（0）0.01（0.02）0.04（0.04）0.16（0.10）0.18（0.05）0.13（0.06）0.27（0.07）0.82（0.26）0.87（0.52）0.40（0.04）0.56（0.16）Ca（NO3）20（0）0.85（0.24）0.90（0.27）0.68（0.25）0.75（0.16）0.48（0.10）0.31（0.14）0.27（0.17）NDNDNDCaCl20（0）1.33（0.32）2.07（0.14）2.32（0.20）3.25（0.22）3.88（0.60）4.48（0.11）3.72（0.61）3.35（0.78）3.80（0.51）ND/cfu）*Numericalvaluesinparenthesesarestandarddeviation.ND=nodata.2.22CM上添加不同无机盐对大肠杆菌-链霉菌用2CM为接合转移培养基，分别添加不同浓度NaCl增加1倍以上（P&0.05）；添加MnCl2反而严重抑制接合转移。根据接合转移子数计算得接合转CaCl2的作用最从表2中可以看出，移频率（表2），120mmol/L时接合显著，添加浓度为100mmol/L、－6转移频率最高，大于8×10接合子/cfu；其次为接合转移频率的影响NaCl、Ca（NO3）2、CaCl2和MnCl2，的MgCl2、每个浓度做3个重复。每个接合转移使用的链霉菌孢子数7目为2.56×10cfu，大肠杆菌细胞数为5.17×MgCl2，60和80mmol/L时接合转移频在浓度为40、－6率接近或超过5×10接合子/cfu；添加Ca（NO3）2107cfu，供受比为2.02。接合转移平板覆盖抗生素后继续培养，第3－5天观察接合转移子，结果如下：阴性对照没有长出菌落；2CM平板上接合转移效率较高，不额外添加无机盐的大部分平板都能长出约20个抗性菌落；额外添加MgCl2、Ca（NO3）2和CaCl2能使接合转移子数增加2倍以上（P&0.01）；添加表2Table2Concentrationofsalt/（mmol/L）200*浓度为40和80mmol/L时，频率也接近或超过5×10－6接合子/cfu。与添加20mmol/LMgCl2的常规接合转移条件相比，添加100mmol/LCaCl2使效率提高2.7倍，添加40mmol/LMgCl2使效率提高1.7倍。2CM上添加不同无机盐对大肠杆菌-链霉菌接合转移频率的影响－6Effectsofdifferentsaltinthe2CMmediumontheE.coli-StreptomycesconjugationefficiencyE.coli-Streptomycesconjugationfrequencyon2CMmediumsupplementedwithdifferentsalt/（×10MgCl21.08（0.03）3.26（0.92）5.62（0.66）4.77（0.45）5.09（0.17）3.79（0.55）4.01（0.44）4.38（0.31）2.62（0.59）2.57（0.60）1.17（0.32）NaCl1.38（0.35）2.45（0.33）2.85（0.56）2.59（0.40）2.55（0.14）2.52（0.35）2.55（0.59）2.14（0.75）2.43（0.53）2.27（0.62）NDCa（NO3）21.29（0.77）5.11（0.37）4.32（0.85）4.89（0.21）3.19（0.42）2.78（0.40）1.09（0.63）NDNDNDNDCaCl20.59（0.32）3.88（0.92）3.79（0.75）7.52（1.26）6.06（1.02）8.65（1.46）8.19（1.74）7.53（1.72）7.28（1.20）NDND/cfu）*MnCl21.17（0.35）0.01（0.11）0（0）0（0）0（0）0（0）0（0）0（0）0（0）0（0）0（0）Numericalvaluesinparenthesesarestandarddeviation.ND=nodata.余姣姣等：无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响./微生物学报（）15592.3完全随机实验寻找优势组合MgCl2对2种接合从上述实验中观察到CaCl2、只有约1%的菌落能看到浅蓝色的合转移平板上，色素产生，这些产色菌落在滴加微量醋酸后蓝色变成红色，可能是表达了放线紫红素；其余绝大多数菌落没有表达。（2）然而，在添加80和100mmol/LCaCl2的F3的培养基上，大多数接合子都表达出蓝色的放线紫红素，其中部分菌落产生较多色素，表达量明显高于其它菌落；一些抗生素分泌出来使培养基呈浅蓝色（图2）。转移培养基上的接合转移频率均具有极显著影响，因此设计完全随机实验以期寻找到优势组合。对CaCl2选取浓度为0、60、80、100mmol/L；对MgCl240、60、80mmol/L；每个组合3个平选取浓度为0、板，即3个平行重复进行试验。组合表及接合转移结果如表3所示，实验中供体细胞大肠杆菌数目为0.9×106cfu，受体细胞链霉菌孢子数目为9.45×－3108cfu，供受比为0.95×10。从表中实验看出，不同组合的接合转移效率区别显著，其中最高组为60mmol/LCaCl2和60mmol/LMgCl2，其效率分别60mmol/L和是添加单一组份MgCl240mmol/L、80mmol/L试验组的6倍、11倍和9倍（P&0.01），是80mmol/L和100mmol/L单一组份CaCl260mmol/L、2倍和1.7倍（P&0.05）。试验组的3倍、表3MgCl2组合对接合转移效率的影响不同浓度CaCl2、EffectsofcombinationsofdifferentconcentrationofCaCl2、MgCl2ontheconjugationfrequencyGroup*图1Fig.1接合转移子的PCR验证ConfirmationofselectedtransconjugantsbyPCR.Table3CaCl2/（mmol/L）MgCl2/（mmol/L）6080ConjugationFrequency/－7*（×10/cfu）0（0）2.89（0.68）1.55（0.32）1.83（0.49）5.29（1.48）9.66（0.95）17.35（3.92）6.98（0.73）7.83（2.24）10.09（0.88）9.31（1.53）10.44（1.53）10.17（0.99）4.15（1.10）3.53（0.61）0（0）图2Fig.2放线紫红素在阿维链霉菌中的表达ExpressionofactinorhodininS.avermectilis.A：Numericalvaluesinparenthesesarestandarddeviation.2.4放线紫红素在阿维链霉菌的异源表达随机挑选6个接合转移子，抽提总DNA作为模NRRL8165：：pMM1；B：NRRL8165：：pSET152.但是，将来自2CM和F3培养基的接合子转接ISP4、到ISP2、放线紫红素发酵培养基R2YE以及阿2上培养，观察产色素情况，均维菌素发酵培养基1，未观察到明显的放线紫红素表达。只有在含80－100mmol/LCaCl2的F3上可以观察到明显的表达。作为阳性对照，放线紫红素的天然产生菌天蓝色链霉菌在上述培养基上都能大量合成放线紫红素。板进行PCR扩增，都扩增出预期大小的阳性信号（图1），表明pMM1接合转移到链霉菌中。在上述各种接合转移平板上观察放线紫红素在阿维链霉菌的异源表达。2CM平板上均没有观察到明显的放线紫红素表达。在F3接合转移平板上放线紫红素的表达有两种情况：（1）在大多数F3接1560JiaojiaoYuetal./ActaMicrobiologicaSinica（）3讨论链霉菌体内遗传操作的手段有接合转移、电转参考文献［1］KieserT，BibbMJ，ButtnerMJ，ChaterKF，HopwoodDA.PracticalStreptomycesGenetics.Norwich，UnitedKingdom：TheJohnInnesFoundation，2000.［2］UteG，ShenB.Expressionofbiosyntheticgeneclustersinheterologoushostsfornaturalproductproductionandcombinatorialbiosynthesis.ExpertOpiniononDrug化和原生质体转化等。电转化和原生质体转化条件激烈，对细胞伤害大，使链霉菌基因组很容易发生突不变；大肠杆菌-链霉菌双亲本接合转移条件温和，易产生突变，逐渐成为最常采用的手段。不同的链霉菌接合转移效率不一样，有高有低。影响接合转移效率的因素有很多，如供体菌、受体菌、供受体菌比例、质粒大小以及接合转移培养基等，培养基中补加MgCl2能够显著提高接合转移效率［11］Discovery，9-437.［3］IkedaH，IshikawaJ，HanamotoA，ShinoseM，KikuchiH，ShibaT，SakakiY，HattoriM，pletegenomesequenceandcomparativeanalysisoftheindustrialmicroorganismStreptomycesavermitilis.Nature531.Biotechnology，6-［4］SambrookJ，RussellDW.MolecularCloning：A。本研究发现，补加CaCl2能极显著提高接合转移效率，其作MgCl2进行组合效果用甚至比MgCl2好；将CaCl2、在添加浓度为20－100mmol/L时，还最佳。另外，观察到CaCl2对链霉菌生长和产孢都有轻微的促进作用，菌落变大且产孢更好；在添加MgCl2或CaCl2≥120mmol/L时，链霉菌生长受到一定程度的抑体现为菌落变得很小。因此，在不同链霉菌中应制，用本研究结果时，需要注意。由于次级代谢基因簇一般包含十几个到几十个基因，携带完整基因簇的质粒比载体质粒大得多，其接合转移效率急剧降低。如本研究中用到的pMM1比pSET152的接合转移效率低10－100倍，常常只得到少数的接合转移子。在各种培养基上观察到不我们很难判断是由于培表达放线紫红素的情况下，养基不合适，还是由于这少数的接合子中pMM1携带的基因簇没有完整进入宿主、或是发生了变异所每个平板上有几百个接合子，而导致。优化条件后，100mmol/LCaCl2的F3培养基上绝大多且在含80、数接合子均表达放线紫红素，表明基因簇的所有必需基因都进入到宿主菌，也暗示在其它条件下不表达是培养基不合适所导致的。至于阿维链霉菌需要在含高浓度CaCl2的F3培养基中才表达放线紫红2和放线紫红素发酵在阿维菌素发酵培养基1，素，表明其生物合成在原培养基（R2YE）均不能表达，始产生菌和异源宿主中受到很不同的调控，其机理尚需要深入研究才能阐明。laboratoryManual.3rded.NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001.［5］HIkeda，HKotaki，HTanaka，SOmura.InvolvementofglucosecatabolisminavermectmproductionbyStreptomycesavermitilis.AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2-284.［6］张和春，季文明，王武.天蓝色链霉菌产蓝色素的工业化培养基优化.无锡轻工大学学报（JournalofWuxi）：138-141.UniversityofLightIndustry），［7］袁丽蓉.抗生素（Antibiotics），0-387.［8］SongY，CaoGM，ChenZ，LiJL.SelectionofhighavermectinsproducingstrainandidentificationofavermectinB1.ShengWuGongChengXueBao，）：31-35.［9］FlettF，MersiniasV，SmithCP.HighefficiencyintergenericconjugaltransferofplasmidDNAfromEscherichiacolitomethylDNA-restrictingstreptomy-cetes.FederationofEuropeanMicrobiologicalSocieties.FEMSMicrobiologyLetters，（2）：223-239.［10］赵斌，何绍江.微生物学实验.第二版.北京：科学出版.社，［11］ChoiSU，LeeCK，HwangYI，KinoshitaH，NihiraT.IntergenericconjugaltransferofplasmidDNAfromEscherichiacolitoKitasatosporasetae，abafilomycinB1producer.ArchivesofMicrobiology，：294C298.包含各类专业文献、各类资格考试、专业论文、行业资料、高等教育、无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响62等内容。　
　链霉菌接合转移体系研究的提出为分子育种打开了一 ...所用酶系中,限速酶的浓度大小是影响抗生素产量的...[8]通过基因敲除放线紫红素合成基因构建了工程表达... 　其酒石酸盐和磷酸盐易溶于水。 耐热链霉菌是一种...基因的中断会激活沉默的放线紫红素 生物合成基因簇...目前本实验室已构建了耐热链霉菌大肠杆菌的接合转移...}