用PHOTOSHOP CS6创建一个3D文字的片头动画
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用PHOTOSHOP CS6创建一个3D文字的片头动画
小编今天为大家推荐一个用PHOTOSHOP CS6创建一个3D文字的片头动画，为了便于说明，小编在文中括号内加入了相关的注释，希望能共同学习，激发更多创作灵感。步骤1 新建文件首先，新建一个文件，由于我们将渲染出一个高品质的3D动画，在制作过程可能会占用你电脑很多内存，因此如遇卡机，请务必保持蛋定。（注：在使用3D拓展功能前，确保你cs6安装的是拓展版，并且在编辑—首选项—性能中打勾选了使用图形加速器/OpenGl，建议也多设置一两个暂存盘）好，考验耐性的时候到了。我们将要制作一个动画，我曾被无数次地问起动画面板在ps的哪里。如果你选择默认的安装方式装了Photoshop cs6，你会在界面的左下角发现两个标签，分别叫Mini Bridge和Timeline（时间轴）。（注：Bridge是Adobe系列的文件预览和管理软件，mini Bridge即内置在PS中的迷你Bridge。另外，若看不到这两个标签，可从菜单栏的”窗口”下拉菜单中调出）双击Timeline标签（时间轴），展开面板，空空如也，这是因为我们还没开始制作动画。接着我们将加入一些元素，就会出现一些层，你可以将其理解为视频的图层。（注：作者所说视频的图层即视频轨，轨道上可以放置一个或多个视频片段，还可以增加多个轨道，轨道以时间维度延展）步骤 2 创建3D文字层开始制作，首先创建一个文字层，选择工具栏中的文字工具。键入文字”tuts”在字体选择框中键入Blippo，找到Blippo系列字体后选择Blk BT类型的。做这一步前首先要确定你系统中有安装Blippo Blk BT字体。你将得到如下的字形。接着给文字加上3D立体效果。点击顶部菜单栏的3D菜单，选择”3D挤出所选层”（注：”挤出”命令相当于给二维的图形加上第三维度的厚度）选择后会弹出一个对话框，询问你是否要将工作区转换成3D的工作区，由于我们接下来的步骤都涉及到3D，请选择yes。看见没，出现了网格线！字体已经呈现在3D的工作区中了。在右边常用的图层面板中，你会发现多了一个3D的标签，里面包含了新场景中所有的3D元素。现在，字体转变为了3D模型了，其形状包含了几个部分，每个部分拥有独立的材质，如下图所示。选中下图所示的所有材质。（注：作者所说的几个部分分别是前平面材质、前面倒角材质、挤出部分材质以及背面和背面倒角材质）然后，如下图所示，进入属性面板（在右上角区域），选择最简单的空材质球，点击漫反射颜色选项。（注：通过调整材质球的材质参数，同步到三维模型的某一部分上，前一步骤选中所有模型每一部分材质，所以是对整个模型赋予相同材质。这里的漫反射颜色设置相当于给模型指定了固有色。相关光照知识推荐参看/tag/5/2/4/5e309f68dd659e84fa7f.html）在我们熟悉的颜色选择器面板里，把取色点移至左上角，给漫反射颜色赋予白色。接着改变环境色，如下图所示，单击环境色的颜色块。如图，选择一种浅灰色。（#c7c7c7）现在我们选择图层的父级元素，即下图tuts组，以便于我们对模型进行整体的旋转和移动。回到属性面板，选择”坐标”按钮（在最上方一栏），设置X轴旋转90度，这样，物体就平躺下了。（注：该设置意义是以X轴为旋转轴，旋转90度。 面板中三列分别代表移动、旋转和缩放。）接下来我们稍微减少文字挤出的厚度，如下图，还在属性面板中，切换到”网格（mesh）”图标，将”挤出深度（extrusion depth）”的值减少到48。完成以上所有步骤后，接下来，选择的3D菜单中”将物体吸附到地面”的命令，如下图。这样就把字体模型摆到了水平面。现在，创建字体模型的工作就完成了。步骤 3 地面平面我们上面一直在说”地面”，但事实上我们还没有一个真正的地面模型。接下来，以视图中的网格为参照，我们来创建一个地面模型。在工具栏中选择长方形矢量工具，拖拽出一个覆盖整个画布大小的长方形。接着，将新建的这个长方形指定到3D视图中，首相要把它变成一个3D物体，如下图， 3D菜单—&从图层中新建网格—&深度映射到—&平面完成后，将得到一个新的3D层，这一层出现在一个全新的3D场景中，但这不是我们想要的结果，我们要把新建的平面放到与我们的字体相同的场景中去。切换回普通的图层面板，如下图，选中这两个图层。然后，点击3D菜单，你会发现一个”合并3D图层”的命令，如下图所示。然后，切换标签回到3D面板，我们会发现除了原有的叫tuts的物体外，又多了一个叫rectangle_1_layer的物体。而在图层面板中，整个3D场景仅包含在一个图层中了。如下图。接着，我们来调整观看的视角，从顶部俯视字体模型，（在3D面板中选中当前视角（current view））。在 “属性”面板里第一栏图标中，选择 “坐标”，如下图所示修改参数，或者在3D场景中通过拖拽视图，调整视角，直到得到顶视图视角。如下图所示，我们得到了顶视图效果。得到正确视角后，你是否注意到，地面显得非常暗，无论你最初创立地面平面时选择的是什么颜色，现在看上去都是漆黑一团。因此我们要给地面设定3D材质，先选择字体模型的某一部分，如下图选择了前平面的材质层。你会在属性面板的材质设定中看到我们之前设置好的材质球，我们将不用重新设置，复制相同的材质给地面即可。方法如下。如上图红箭头所示，点击材质球缩略图右边的小三角下拉菜单，再点击最右边的齿轮图标设置按钮，在展开设置选项中，选择如下图所示的”新材质”选项。这时会弹出一个对话框，你可以在输入框中给新材质命名，然后点击ok即可。在3D图层面板中选中长方形，如下图。再回到”属性”面板，点击材质球的缩略图小三角，展开材质球面板，滚动下拉到最底，你会发现刚才新复制好的材质球（鼠标悬浮材质球上，会显示其命名），选择这个材质球。这样我们模型都设置好了。步骤 4 光照通常在ps中，调整光照效果自然会想到添加一些调整层，再加上阴影效果，对不？这回错了！我们要把思维转换成在3D的工作环境中，要设置3D场景中的光照，我们设置上几个光源。首先，选择场景中已有的光源。（即下图所选的3D面板中的平行光1（Infinite Light 1））在工作区预览中，出现了用于调节灯光的操纵杆，目前显示光源是位于文字模型的前方，于是文字模型的后方产生了一块黑暗的投影。让我们拖拽操纵杆的小球，按照下图红箭头所示的路径，沿着光源的边缘改变光照方向。你也可以在灯光的”属性”面板的坐标轴中进行参数调整。如下图。PS通过OpenGL渲染引擎，实时地将操作结果呈现在视图中，显示出物体收光效果、阴影投射方向等等。这里，我们想达到的光照效果是阴影从右上角向左下角的方向投射。接着，我们再新建一个光源，在3D面板的最下方有一个通常用来新建层的小图标，这个图标在3D面板中是用来创建光源的。点击后在下拉菜单中选择”新建平行光”（new infinite light）。如下图所示，新建的光源出现在视图正上方。在”属性”面板”坐标”中对灯光位置进行精确调节，参数如下。同时在”属性”的”平行光”里，调节参数如下图所示（intenstiy指的是光照强度，softness指的是灯光边缘的柔化程度）回到3D面板，选择默认的那个光源——平行光1同样对其属性中光照参数进行设置，如下图所示用上述方法再新建两个光源改变平行光3的光照颜色，在”属性”—&”灯光”面板上点击颜色属性的长方形取色框。在弹出的取色器里选择如下图所示的浅红色。（#e2c4c4）然后按照下图所示，调整光照强度和柔化值选择第4个光源，同样对其光照色彩进行调整。这回选择一种蓝色。（#6ba9c0）如下图调整光强和柔化参数。选中第四个光源，调整其坐标位置，参数如下图所示。该参数会将第四个光源设置在第一个光源的斜对面，作为第一个光源的补光。（注：补光作用是为了弥补主光源所产生投影过黑，在阴影处增加一定的光照）然后我们调整第三个光源的坐标位置。同样，先在3D面板中选择平行光3。如下图所示参数，旋转光照方向。好了，整体设置完成，如下图所示。第一个光源从右上角照射出光线，与地面成角较低，因此在左下角得到一个斜长的文字阴影第二个光源（黄色箭头所示）从较高的角度照向右上角，减淡了第一个光源所产生的阴影，营造出较柔和的光照环境，同时产生了整个文字基底与地面贴合的缝隙阴影。第三个光源提供了粉红暖色的补光，使光照效果显得十分柔和。最后，为了营造光照冷暖的对比，第四个光源照射出淡蓝色的冷光，同时也减淡了主光源产生的阴影。至此，我们场景中光照就设置好了。步骤 5 制作平滑的边缘倒角接下来，我们调整一下文字模型，使它产生柔和的圆角和边界。如图，选择整个文字模型。在”属性”面板，单击选择”盖子”（Cap）图标，如图所示调整参数设置。点击等高线缩略图的下拉按钮，即下图中用红色大圈圈出的那个设置项。（注：这里设置的是模型边缘的倒角，可以产生类似盖子的感觉）如下图，在下拉框中选择圆角曲线模式。设置好后，立马可以看到模型边缘出现了柔和的倒角边快速渲染后，我们能看到大致的细节效果。这样我们就调整好字体模型的倒角了。步骤6&动画好的，接下来我们准备制作动画了。首先，点击时间线标签，打开时间线面板。打开后，点击中心的按钮，创建一条时间轨。很快，出现一个包含着tut场景的长长的视频轨道，以及一个音频轨道。如图，点击左边的三角形箭头。展开的面板呈现了3D场景中的全部可以设置动画的属性。首先，我们选择3D摄像机的位置属性。在默认情况下，整条视频轨道都是可渲染的工作范围，我们可以拖动在最末端的的操纵杆来改变工作范围，下图红色箭头所示。（注：该控制杆限定了轨道上工作区的长度范围，从而指定了渲染范围。）将操纵杆向左拖动到3分20帧处。（注：动画是利用视觉滞留原理，由一张张静态图片连起来形成的动态效果，一张静态图片称为一帧（frame），该例子中1秒有30帧，你也可以在timeline最右边的设置菜单中修改视频的帧速率）先前，我们已经设置过摄像机的位置了，这一位置其实是动画最后结束时的位置。点击小码表图标（下图红色箭头所示），在时间轴上就会产生一个黄色小钻石形状的关键帧。（注：关键帧记录了动画变化过程中关键动作或状态的那一帧，在两个关键帧所记录的状态之间平滑过渡变化就产生了动画效果）接着，把刚产生的这个小黄点关键帧移至动画最后一帧。（即30秒20帧处）你有两种方法来移动镜头视角，一是在场景左下角中选择带有3D坐标轴箭头的操作杆，三个箭头分别代表X、Y、Z三个方向。点击操纵杆，按住左键拖动，就可以移动改变视角了。第二种方法是，（先选择3D面板中的当前视角（current view））进入之前使用过的”属性”面板—&”坐标”中，在这里精确调节移动和旋转的参数。第三种方法是，在ps界面上方的工具栏中，可以快速选择移动操作工具。这个移动工具对于所有模型都通用，所以你只要选择了这一工具，点击任何一个模型的显示区域，就会快速选中模型，坐标操作杆也会随之出现。然而，现在我们并不需要移动模型，我们要移动视角。因此，你自己尝试着动一动，看怎么让视图更靠近一些。（注：泄题，要使用该工具调节镜头视角时先点击场景空白区域，按住左右拖动是平移，上下拖动是缩放）得到想要的视角之后，点击关键帧图标（红箭头所示的码表图标），就设置好了动画开始时的第一个关键帧。你可以点击下图所示的播放按钮，来预览你的动画。你也可以修改开始和结束帧至满意为止。让时间轴的指示器在现有的关键帧上进行调节，确保不会产生新的关键帧。（注：指示器就是那个预览时会移动的那个带红线的物体，工作区显示的画面即它所在的帧）点击播放，你可以通过指示器查看到动画的每一帧。你也可以把它放置在开始或结尾帧上，给其他物体层增加和选择关键帧，设置关键帧动画。步骤7&添加调整层并设置调整层动画我们将给3D场景统一使用一些常用的调整层，并且给调整层设置动画。首先，在图层面板中，创建一个照片滤镜（photo filter）调整层。在属性面板中，选择过滤器（fliter）为暖色滤镜（warming fliter）在时间轴面板中，将出现照片滤镜的新轨道层。接着， 在比2秒处稍稍多一点的位置打上一个新的关键帧，如下图所示。在这一帧上，我们设置透明度为0.移至动画最后，再打上一个关键帧。设置最后一帧透明度值为30%好啦~现在在图层面板最顶上建立再新建一个照片滤镜调整层，如下图所示如下图参数，这次使用冷色滤镜，设置密度为25%回到动画起始帧，如下所示，在开始处创建透明度关键帧：透明度设置为100%在大约3秒处，创建第二个关键帧透明度设为0最后，在最上层新建一个色阶调整层（level）在属性面板中调整 参数如下图所示回到时间线面板，在透明度属性开始处设置一个关键帧设定其透明度值为100如下图，在约2秒8帧的位置上打上第二个关键帧设置第二个关键帧透明度为0完成了这一步后，现在最上方创建一个空图层选择颜色填充工具，将这层的颜色填充为100%的黑色 （即K值100%）点击滤镜菜单，选择渲染——&镜头光晕在对话框中调整镜头光晕效果如下图所示选择图层模式为叠加（screen）回到时间轴版面，在这一图层约1秒之后一点的位置创建一个新的关键帧然后在2秒之后连续打上5个关键帧，位置如下图所示，不需要特别精确，差不多就行了。保持下图圈出的这两个关键帧透明度值为100%，然后拖动指示器到第三个关键帧处把该帧的透明度值设置为23%再拖动指示器到下一帧设置透明度值为73%继续移至下一帧设置透明度值为0。至此，我们把所有新建的层的动画都设置好了。点击播放按钮，预览一下我们的成果，如果对现阶段效果满意，咱就接着下面的操作。（注：这一步设置得效果是：整个场景光照调子随视角变化产生的变化效果）步骤8 渲染和配音虽然这步挺简单，但力求产生好的渲染效果是我们必须足够重视的问题。如下图所示，点击那个箭头状的图标。然后会弹出一个有很多设置项的对话框。让我们从左上角的参数开始逐一设置。第一步，给视频起一个名字，选择一个用于保存的目标文件夹。然后如图，选择一个视频解码器Adobe Media Encoder。选择渲染范围为工作区。最后选择渲染品质为渲染品质。在此之前，我已经用低渲染品质进行过几次的测试渲染，低品质渲染差不多要用几分钟，而当你要出最终的效果时，需要进行更细致的渲染，渲染的结果也会更好。渲染效果和时间取决于你的电脑性能，通常都会有点久，这就是为什么我们要保持文件大小适中的原因（减少计算资源）。顺便讲讲如何在动画中加入音频吧。音轨在时间轴面板最下一栏，在其最右边找到加号图标，如下所示点开，选择你想导入的音频文件。音频文件的时长可能远超过你所设定的动画时长，不过这没关系。你可以左右拖拽所选的音轨素材，直到与动画相匹配。我选择了快接近结束的那段音乐来配合我的动画。如下图，.滚动指示器到工作区最后，选择剪刀工具。这个工具可以用来剪断那段音频你可以把不要的那段音频删除。然后在音频素材上右键，调出淡入淡出控制面板，这个面板的参数设定主要取决于你所选的音频素材，但这是你在ps中对音轨的所有可控设置项了。我喜欢最后来调整音轨，因为3D渲染已经够占用资源的了，因此，音频可以最后再加入。最后在这个教程中，我们使用了CS6中基本的3d和动画功能，当然较大的动画和关键帧控制还是在AE或nuke里完成更好。但对于精小简洁的动画，使用ps来制作还是别有意趣的。我相信，ps会在这方面发展更好的，未来功能会强大得超过nuke。
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& CopyRight , , Inc.All Rights Reserved.AUTOCAD 3D里面REVOLVE市什么命令啊？怎么把一个小的物体水平旋转成一个大的物体啊？麻烦详细点_百度知道
AUTOCAD 3D里面REVOLVE市什么命令啊？怎么把一个小的物体水平旋转成一个大的物体啊？麻烦详细点
就是在三维里面一个小的物体经过水平旋转之后就会变成一个大的物体，就相当于那个小的物体拼凑起来的一样
提问者采纳
REVOLVE命令是将二维线框旋转成三维实体，输入REVOLVE命令后选择密封的（闭合的多段线、多边形、圆，椭圆、矩形或面域等）二维线框，回车，指定旋转轴或定义轴依照 [对象(O)/X 轴(X)/Y 轴(Y)]后，回车，输入旋转角度，回车OK。
在三维里面已经是实体的不可以再旋转成另一个大的实体，只能进行比例缩放大小或进行面的编辑。
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&JoVE Bioengineering
3d轨道跟踪的改进双光子显微镜之应用：细胞内的囊泡的跟踪
1Biomedical Engineering, Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine
* These authors contributed equally
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Date Published: 10/01/2014, ; doi:
Keywords: , , , , , , , ,
Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (92), e51794, doi:10. (2014).
这个视频协议的目的是讨论如何使用修改后的双光子显微镜1执行和分析三维荧光轨道粒子跟踪实验。相对于传统的方法（光栅扫描或基于一个堆栈帧的宽域），三维轨道跟踪允许定位和跟踪具有高空间（10 nm的精度）和时间分辨率（50赫兹的频率响应）的三维位移移动荧光粒子的长度尺度数百微米2的。该方法是基于一种反馈算法来控制，以围绕该对象执行的圆形轨道上的双光子激光扫描显微镜的硬件要跟踪：反馈机制将保持在中心的荧光物，通过控制的位移扫描光束3-5。为了证明这项技术的优势，我们跟着快速移动的细胞器，溶酶体，内人艾尔文细胞6,7。细胞根据标准方法镀，并用市售溶酶体染料染色。我们简要讨论的硬件结构和详细的控制软件，以执行在活细胞内的3d轨道的跟踪实验。我们详细讨论，以控制所述扫描镜和使该光束的动作在颗粒周围的封闭轨道所需要的参数。我们得出结论：通过展示如何此方法可有效地用于活细胞内跟踪沿在三维微管标记的溶酶体的快速运动。溶酶体可以用移动的速度在0.4-0.5微米/秒的范围内，通常显示沿微管网8定向运动。
大量方法已被开发出迄今为止为在使用显微镜的三维跟踪荧光发色粒子。大多数方法依赖于使用的快速照相机，非常适合以跟踪在两个维度上，典型地结合了镜的出射光学系统的定制修改，以实现跟踪在轴向方向上。激光扫描显微镜（或者共聚焦或两个光子）通常可以追踪的荧光粒子通过进行的Z-堆栈的时刻的顺序，尽管这种过程通常是耗时的，并且会产生合理的时间分辨率（10赫兹）只有当被跟踪的粒子是由有源反馈机制2保持在一个小的光栅成像区域的中心。 锁入到该颗粒的想法是在轨道的跟踪方法的基础。取而代之的是光栅扫描的圆形轨道围绕的荧光粒子进行。荧光沿强度轨道精确本地化粒子的位置4。 该颗粒的局部位置然后可用于致动显微镜扫描器和重新中心在粒子位置的轨道。显微镜的检流计扫描仪是由一个模拟电压驱动。这个电压的AC分量允许用聚焦激光束进行的轨道， 即正弦波和施加到X和Y扫描反射镜将允许执行一个圆形轨道上的余弦波。直流信号的偏移有助于改变轨道中心的位置。一旦一个轨道期间被确定并且对于交流信号的波形构成，所述反馈系统需要更新信号的唯一的直流分量。 软件能够读取从检测器收集到的荧光信号是必需的，以控制扫描仪和检测器，来计算粒子的位置和更新的直流断设定。对于一个成功的反馈成像仔细选择的轨道参数（大小和定时）的需要和这些参数具有基于所述荧光体颗粒，有必要进行跟踪的特性来进行调整。 该技术的物理和数学基础，在过去4,5 2D和3D应用程序进行了描述。在这个协议中，我们简要地描述了安装的主要硬件部件，并且更详细的参数的选择和样品制备所需的典型的实验中，使我们以下溶酶体中的活细胞内的高时间分辨率的位移。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
1，样品制备保持在使用补充有10％胎牛血清和100 IU / ml青霉素链霉素50微克/毫升的组织培养瓶中的CHOK1细胞。培养细胞在5％二氧化碳培养箱在37℃。 嘉实然后板CHOK1细胞在14毫米直径的微孔与0.16毫米的表面厚度。种子细胞用于成像的最佳密度，周围60-70％汇合。 过夜孵育细胞，在37℃，5％CO 2。在HBSS（汉克缓冲盐溶液）中含有50nM的Lysotracker DND26绿色和150纳米的微管蛋白的跟踪绿色的溶液中洗涤细胞三次，并孵育细胞。孵育细胞1小时，在37℃。可选步骤：孵化前，用线粒体基质染色的染料（25纳米）执行额外的污点。 在HBSS洗涤细胞三次，以除去任何未结合的染料。前IMAG加入新鲜的DMEM培养基荷兰国际集团的细胞。
2，显微镜配置显微镜在视频协议中描述的粒子跟踪组装市售的倒置显微镜（ 图4）的框架上。三维轨道粒子跟踪然而商业模块现已上市。 使用相干变色龙超二钛萨飞秒激光激发光源，与690之间的NM-1040 nm的可调输出波长范围。 确保激光束在显微镜的后部端口使用的IR-涂覆的镜子对准。激光束被使用旋转半波片之后是方解石线性偏振衰减。衰减的光束，使得在样本的平均功率为0.5?2毫瓦。 注：该激光束由一对检流计电机致动反射镜，使在样品平面中聚焦光束的位置和轨迹的控制反映。在典型配置的准直激光束出射的检流计反射镜被扩展（10X）穿过光束扩展器，在短通分色镜反射后进入显微镜物镜的后前。 通过将高数值孔径物镜水（60X，NA 1.2）插入光路收集来自样品的荧光的光。根据在一个或两个信道配置所需的发光波长选择在荧光滤光块。采用发射带通滤波器，以进一步选择所发射的荧光的光谱范围。 将样品放置到电动阶段，并调整显微镜物镜的使用目的压电控制器的微调。 直接从过滤立方体进入光电倍增管信号在那里被歧视，送到数字I / O数据采集卡的光。 注：电脑产生的波形是I / O卡的模拟输出，并provid编辑的扫描仪控制电子设备。从光电倍增管和输出信号提供给扫描仪的光子计数输入被测量，并且经由I / O卡的实验室荧光动力学SimFCS软件控制。
3，影像学定位在舞台上的细胞，并集中使用透射光照明。 切换到光栅扫描成像，以确定已将染料的细胞，以可视化的底层微管。确定初始区域囊泡运动存在。 一旦分离的囊泡被识别时，设定为轨道跟踪参数如下： 选择的轨道半径，根据该颗粒的大小被跟踪来定义圆形扫描的大小。对于一个点发射器，设置在轨道等于激发束以最大化灵敏度和响应的点扩散函数（PSF）的腰部的半径。 设置轴向距离，以定义在执行本地化沿轴向的粒子位置两个轨道之间的距离。设定为1.5-3倍的PSF腰部的轴向距离。 根据颗粒来设定使用了上各点的轨迹，这也决定了光漂白速率的时间的亮度定义的停留时间。使用10-100微秒之间的停留时间。 点中每个轨道的数目设置为64或128，以产生轨道周期为4-32毫秒的顺序和用于确定粒子的位置提供了一个高的时间分辨率。 改变直流发送到反射镜，以通过光栅扫描图像中的光标选择通过图形用户界面，以围绕所述颗粒的光束偏移信号。 首先从开关光栅成像显微镜模式，以轨道扫描跟踪。 激活的反馈和数据收集。
4 TrajectORY分析使用该软件，以显示在沿着轨道和在一个“强度地毯”的形式中，每个时间点的每个点所收集的荧光。沿着所述地毯收集的强度提供了与其它明亮物体的粒子之间的相互作用的信息。使用软件（在X，Y扫描仪且z -piezo的时间，即直流偏移）以及来自光电倍增管中的时间序列的形式收集的随着时间的荧光强度，以显示两个轨迹信息。 使用时间序列的代表性和“强度地毯”的信息来选择的轨迹的兴趣只是一个区域。 使用该软件，显示粒子轨迹的所选部分的二维投影。根据颗粒的荧光强度选择适当的控制，以颜色编码的轨迹。 选择要显示在p选项根据荧光强度的文章轨迹在3D和彩色编码的。旋转用控制形象化沿微管的溶酶体运动的特征的轨迹在三维。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
根据这一协议，快速的3D单粒子跟踪可以在里面用改进的双光子显微镜来跟踪荧光标记的溶酶体的位移活细胞中进行。进行实验包括跟踪一个孤立的溶酶体内体成熟过程后，9移动单元格中的。溶酶体用荧光绿色染料染色，激发在930 nm的利用双光子激发。我们的数据表明，有可能获得的x，y和z的位移轨迹具有32毫秒（ 图1a）的时间分辨率。地毯分析显示沿各轨道上的时间（ 图1b）记录的强度。期间的跟踪发射的荧光的积分强度可以被记录（ 图2a）。重建的三维轨迹显示的定向运动，如从泡囊移动的微管网络上可以预料的。 ádditionally，能够关联的三维轨迹的周边区域（ 图2b）的光栅扫描的图像。这证实了沿微管束的方向，颗粒的运动。 将细胞染色，另外一个红色的标记线粒体其移动过程中记录这些细胞器的囊泡的最终互动。有可能相关的细胞（ 图3a）内的粒子的三维轨迹从mitotracker荧光发射（ 图3b）记录的强度地毯。这使我们能够记录囊泡的接近相互作用的线粒体网络的小区内的位置的函数。记录在“线粒体通道”发光峰值不给出关于这样的细胞器相互作用的功能的信息。它可以提供关于他们的相互影响只是时间信息和被跟踪的相对于该粒子的荧光物体的相对空间位置。这个相对位置，从那里发光峰值被记录在轨道内的角度萃取。我们用来执行该实验的显微镜的示意图在图4中可以观察到。
图1位移与时间的轨迹和强度的地毯。一） 的x，y和z溶酶体位移与时间的关系的痕迹。 二）强度的轨迹（ 即沿着每个圆形轨道竖直轴线所收集的强度是时间）提供了关于颗粒的荧光环境信息。的盒装外亮点对应于与其他明亮的天体粒子的相互作用，并在轨迹的日相关联的跳跃 ê轨道上最亮的荧光源重新中心。盒装区域对应于轨迹的部分在两跳之间。
图2：继溶酶体的三维轨迹。收集利用粒子跟踪一）3D溶酶体的轨迹的一部分重建。该轨迹是颜色编码为从粒子收集到的荧光强度（红色，高，蓝色，低光子计数）。轴刻度是纳米。注意，X，Y，Z轴有不同的范围。的三维轨迹的二）2D投影，在成像中的栅格的微管立即扫描的顶部显示该轨迹的覆盖的轨迹被收集。 三）线粒体染色的mitotracker后。 再3“SRC =”/文件/ ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg“/&
图3扩展的轨道跟踪到一个以上的通道（激发波长930纳米）。一）细胞。 二）绿色通道（收集此通道的荧光强度地毯内的溶酶体的三维轨迹，用于跟踪）。 三）在红色通道，其中线粒体沾满了红色荧光强度矩阵地毯有针对性的染料。其中的轨迹变得与线粒体（箭头）相接触的区域出现在地毯强度凸点，当光束周围溶酶体轨道跨越进入线粒体基质。
图4示意图实验装置：改良的双光子显微镜 。的激光设置示意图：2光子钛萨激光射程690-1,040纳米是我们编，偏振器和一个半波片，用于控制的激励功率。所有其他项目列在使用指定缩写的数字。我们使用了60X的目标与1.2 NA。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
尽管荧光显微技术及仪器，在过去几年取得的荧光粒子在三维空间运动轨迹具有高时间分辨率的巨大进步一直保持在该领域的挑战。如果高时间分辨率已经在两个维度上被实现跟踪颗粒，延伸到轴向方向通常带来大幅减少了系统10的频率响应。 在这个视频协议，我们重点跟踪单个粒子在三维空间中活的细胞中利用双光子显微镜的高时间分辨率（32毫秒在这个实验中）的示范应用。需要进行这样的实验设置通常是可用的，以执行激光扫描显微镜实验室。都是乐器插件的3D轨道跟踪和控制软件可在市场上，对于commercia升激光扫描显微镜，如那些由Olympus生产的。使用的脉冲的高功率红外激光源，其中可用的，是在实验装置，因为它不需要去扫描发射的荧光的设计有利的。此外，它被证明在过去的红外线照射是朝向细胞更良性的，在特定条件11下，给定的聚焦荧光和光致漂白的减少。 虽然可以使用灵敏照相机进行两维的荧光粒子的快速跟踪，由于没有任何三维信息的可以是常限制在解释的轨迹信息的生物物理含义。例如，水疱沿微管运动经常碰到的微管交叉区域8,12。在这种情况下，使用了三维跟踪技术克服了采用三维结构的2D投影的限制。 由于我们的目标纳米定位的压电器件的时间响应，在z轴移动的期间被限制在大约30毫秒，而在x，y方向上它可以深入到几毫秒。该方法的定位精度秤作为信噪比4,5。该方法的唯一明显的局限性， 即颗粒的环境的全局视图的损失，由重建的时间强度的地毯13，跟踪荧光颗粒的相互作用的历史与邻近的荧光来源的可能性补偿显示可以是相同或不同的光谱发射。 我们表明，溶酶体的运动，通过两种驱动蛋白和动力蛋白经受定向沿微管运动，动力小泡，可以跟活的细胞中使用市售的染料染色后。近日，溶酶体的二维跟踪是科尔兴高采烈的微管网络的超分辨率成像，在检测到的囊泡采取在微管的微管的交点8的路由的努力。溶酶体的3D轨迹显示比单向运动更为复杂的行为。虽然平均定向运动可以观察到，弯曲，扭转和沿细管可以旋转可以从这些轨迹进行观察。 我们已经确定在执行这些实验中的两个关键步骤：首先，它是必要的，以实现即在同一时间足够高，以获得明亮的染色颗粒的溶酶体标记密度，而同时提供了颗粒低的密度足以使单个颗粒的跟踪。在两个相交的颗粒的情况下，在显微镜可从一个粒子切换到另一个的同时跟踪。第二个关键步骤涉及的像素停留时间的选择，可以让一个合理的平衡是吐温高信噪比和跟踪速度。我们已观察到，在每个跟踪周期32毫秒的顺序跟踪速度通常足以跟随溶酶体发生在低于1微米/秒的速度快速定向运动。 总之，轨道跟踪允许在三个层面，并与&40毫秒荧光标记的囊泡的胞内运动的时间分辨率来衡量。三维轨道跟踪具有在将来被用于不同的高度动态的细胞过程，如我们的染色质动力学的实时转录和等离子体激元纳米颗粒在细胞内介质的扩散研究的研究的可能性。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Catalog Number
Lysotracker DND 26
Life Technologies
Tubuline tracker Green
Life Technologies
Mitotracker RED
Life Technologies
Coherent Chamelon- ultra II TI
Glan Taylor Calcite Polarizer
Melles Griot
Galvanometer-motor mirror
Cambridge Technologies
Dichroic mirror
Chroma Technologies
700 DCSPXR
Motorized stage
Photomultiplier tube
Data acquisition card
Imaging software
Global for images-SimFCS
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